[发明专利]人γ－干扰素在毕赤酵母菌中的高效表达、发酵和纯化

摘要

设计并人工合成了特别适合于毕赤酵母菌(Pichiapastoris)中表达的人γ－干扰素的基因序列，构建了胞内表达人γ－干扰素蛋白的载体pPIC 3.5K－ifn，采用蛋白酶缺陷的SMD1163毕赤酵母菌(Pichia pastoris)为宿主菌，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得高表达克隆株PichiapastorisSMD 1163(pPIC 3.5K－ifn，his4 pep4 Δprb1)－181.该菌在28－30℃不含甲醇的培养基培养48小时，再在含1％的甲醇的诱导培养基培养36－48小时，γ－干扰素表达量可达菌体总蛋白的25％。每升含γ－干扰素初品约为1克左右。经DEAE－Sepharose凝胶吸附，Sephacryl S－200分子筛层析，DEAE－Sepharose阴离子交换层析，CM－Sepharose阳离子交换层析，得纯度为97.5％以上(HPLC)的人γ－干扰素蛋白。

主权项

1、一种由基因工程菌发酵制备人γ-干扰素的方法其特征在于基因结构如下的人γ-干扰素基因序列，ATG CAA GAC CCA TAC GTC AAG GAG GCA GAA AAC TTG AAG AAA TAT TTT AAC GCT GGT CAT M Q D P Y V K E A E N L K K Y F N A G HTCT GAC GTG GCA GAC AAT GGA ACA TTA TTT TTG GGT ATT TTG AAG AAC TGG AAA GAA GAG S D V A D N G T L F L G I L K N W K E ETCA GAT AGA AAG ATT ATG CAA TCC CAG ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAG CTT TTC AAG AAC S D R K I M Q S Q I V S F Y F K L F K NTTC AAA GAT GAT CAA TCC ATC CAA AAA TCC GTT GAG ACA ATC AAA GAG GAT ATG AAT GTC F K D D Q S I Q K S V E T I K E D M N VAAG TTC TTT AAC TCT AAT AAG AAG AAG CGT GAT GAC TTT GAG AAG TTG ACC AAT TAC TCA K F F N S N K K K R D D F E K L T N Y SGTT ACA GAC TTG AAT GTC CAA CGT AAG GCA ATC CAC GAG CTG ATT CAA GTG ATG GCA GAA V T D L N V Q R K A I H E L I Q V M A ECTT TCT CCA GCT GCT AAA ACC GGA AAG AGA AAG AGG TCT CAA ATG TTG TTT AGA GGA AGA L S P A A K T G K R K R A Q M L F R G RCGT GCT TCT CAA TAG R A S Q Term克隆插入带有甲醇调节型启动子(AOX1)的载体pPIC 3.5K中，获得表达载体pPIC3.5K-ifn，采用蛋白酶缺陷的SMD1163毕赤酵母菌为宿主，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得高表达毕赤酵母株PichiaPastoris SMD1163(pPIC 3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181(菌种保藏号为CGMCC NO.0758，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，经发酵，纯化得人γ-干扰素。