[发明专利]长春花完全适应型细胞大规模培养生成吲哚类生物碱的方法

摘要

本发明属生物工程技术领域。具体涉及一种激素完全适应型长春花细胞培养生成吲哚类生物碱的新方法。本发明以野生长春花种子为原始材料，获得长春花无菌苗，进一步诱导出愈伤组织，经过多代定向诱导驯化，建立了适合大规模培养的激素完全适应型细胞培养系统，该培养物中总生物碱含量和野生长春花相当，但培养物中不含具有细胞毒的长春碱和长春新碱。

主权项

1.一种应用长春花细胞大规模培养生成吲哚类生物碱的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)按配方配制生长和生产培养基：生长培养其mg/L生产培养基mg/L(NH4)2SO413430KNO32000400CaCl22H2O.150210MgSO47H2O250290NaH2PO4H2O15030KI0.75H3BO33.0MnSO4·4H2O10ZnSO4·7H2O2.0Na2MoO4·2H2O0.25CuSO4·5H2O0.025CoCl2·6H2O0.025FeSO4·7H2O27.827.8Na2·EDTA·2H2O37.337.3肌醇100100烟酸1.00.5盐酸吡哆醇1.00.5盐酸硫胺素103蔗糖2％-3％w/v白砂糖3％w/vpH5.6-5.8(2)应用长春花种子经灭菌并培养得到无菌苗，诱导产生愈伤组织，将所得的愈伤组织继续继代培养，在培养基中逐渐减少激素用量，培养8-10代后，将激素逐渐减少到零，如发现生长不良，可补加0.1-0.2mg/L2，4-D，生长好转后又去除激素，同时将培养基pH值降至5.4-5.6；在经过多代驯化后，可形成稳定的激素完全适应型细胞系，在固体和液体B5基本培养基上均能良好生长，固体培养基上的培养周期为4周，液体培养基上的培养周期为12-15天；(3)按生长培养基配方制备生长培养基，调节至pH5.4-5.6，分装于250ml三角瓶中(每瓶50-60ml)，封口并高温灭菌，以生长良好的细胞为种源，接种于上述生长培养基中培养扩增，培养条件为温度25±1℃，暗培养，摇床转速110-120转/分钟，10天继代一次，可以作为种子细胞。如果发现生长不良，需从愈伤组织重新选育；(4)按生产培养基配方制备生产培养基，调节至pH5.4-5.6，分装于1000ml三角瓶中，每瓶300-400ml，按15％W/V接入种子细胞进行培养，温度25±1℃，摇床转速为120转/分钟，黑暗，培养10-12天后可提取生物碱；(5)大规模培养时，反应器培养体积按5-8倍递增，最终一级带补料灌进行生产培养，培养结束后提取生物碱。