[发明专利]利用PCR确定已知DNA序列的两侧未知序列的方法

摘要

本发明是一种利用PCR确定已知DNA序列的两侧未知序列的方法。它是通过对已知序列的限制性内切酶位点进行酶切，设计合适的PCR引物，进行PCR扩增，最后对所得片断进行克隆和序列测定。本发明技术设计简单易行，操作限制少，应用范围广，结果分析简便可靠，而且成本低廉。

主权项

1、一种根据部分DNA序列确定其两侧未知序列的方法，其特征在于通过对已知序列的限制性内切酶位点进行酶切，选择合适的PCR引物，进行PCR扩增，其具体步骤如下：(1)寡聚脱氧核糖核酸引物设计：根据已知序列设计半巢式PCR引物，分别命名为P1和P2，长度为15-25bp，P2比P1更靠近待测的未知序列部分，而且两者可以部分的重叠，P2的3’端距离待测序列要保留15-100bp；合成引物LP，3’末端的四个寡聚脱氧核糖核苷酸为GTGC，长度为15-25bp，表述如5’-XXXGTGC-3’，其中的XXX表示根据基因组DNA的CG含量来设计的11-21bp长度的寡聚脱氧核糖核苷酸；再设计三种寡聚脱氧核糖核苷酸，分别命名为MBO，TAQ和MAE，序列为：MBO：5’-GATCGCAC-3’，TAQ：5’-CGGCAC-3’，MAE：5’-TAGCAC-3’(2)限制性内切酶的选择：根据对已知DNA序列上的限制性内切酶酶切位点的分析，选用在已知序列上没有酶切位点的常用酶，或者选择在从P1到待测的未知序列之间没有酶切位点的酶，对基因组DNA进行酶切，并与三种寡聚脱氧焦糖核苷酸作用；经与寡聚核苷酸作用后，抽提基因组DNA，将基因组DNA用根据上述原则确定的限制性内切酶作用0.5-18小时后，纯化基因组DNA片断；(3)PCR模板构建：按照一定比例将寡聚脱氧核糖核苷酸MBO或TAQ或MAE与LP作用，使LP与相应的碱基配对部分形成双链，再与基因组DNA酶切后的产物在12-25℃用连接酶连接5-24小时；(4)PCR扩增：以步骤(3)中的产物为模板，以P1和LP为首轮PCR引物，PCR扩增待测的未知DNA序列；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收，再用LP和P2进行PCR扩增；对所得到的片段进行克隆和序列测定。