[发明专利]一种检测微囊藻产毒的方法

摘要

本发明公开了一种检测微囊藻产毒的方法，该方法根据微囊藻毒素合成酶基因mcyB仅存在于产毒微囊藻的原理，用mcyB序列设计出特异引物TOX1P/1M和TOX2P/2M，利用全细胞PCR，通过样品的制备、引物的合成、PCR反应、电泳检测来确定微囊藻是否产毒。本发明检测时间短、重现性好、灵敏度和准确性高，所需仪器设备和试剂相对简单，可大批量快速鉴别培养物或自然水样中的微囊藻是否产毒。

主权项

1、一种检测微囊藻产毒的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：A、取含有0.1～5毫克微囊藻的藻液，用3000～6000转/分钟离心5～10分钟，去除上清液；B、加入1～5毫升无菌的去离子水，充分混匀，用3000～6000转/分钟离心5～10分钟，去上清；C、将步骤B重复3～5次，再加入1～5毫升无菌去离子水，充分混匀，得到藻细胞悬液；D、根据TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M两对引物，序列如下：TOX1P：5’-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3’TOX1M：5’-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3’TOX2P：5’-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3’TOX2M：5’-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3’E、将下列试剂加入到试管中：牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩尔MgCl2的10倍热稳定DNA聚合酶反应缓冲液，四种单核苷酸(dNTPs)各0.2微摩尔的混合物；引物对TOX1P/1M20pmol；热稳定的DNA聚合酶(TaqDNAPolymerase)0.5个单位；6微升藻细胞悬液，再加入去离子水至总体积20微升；F、用DNA聚合酶链式扩增反应仪，进行PCR；采用下列参数：起始变性93～96℃，1分钟，循环数30个(92～96℃，15～25秒；55～57℃，25～40秒；72℃，50～60秒)，后处理过程72℃，7分钟，得到引物对TOX1P/1M扩增的片段；G、将步骤E中的引物对TOX1P/1M换成引物对TOX2P/2M，其它试剂与步骤E相同，重复步骤F的操作，得到引物对TOX2P/2M扩增的片段；H、选取确定产毒的微囊藻扩增到的特异性片段作为阳性对照，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果微囊藻样品中扩增的特异性片段与阳性对照中特异性片段在同一条直线上，则表明该片段与阳性对照的大小一致，是产毒微囊藻。