[发明专利]大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法

摘要

一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，在农杆菌介导BT基因对大豆茎尖转化的过程中，采用大豆种子消毒后萌发、去除顶芽，并造成表皮分生细胞损伤，作为外植体，在真空压力条件下进行农杆菌感染处理，在萌发培养基上进行共培养，用一定量的硫酸卡那霉素加入芽伸长培养基和生根培养基进行筛选，能得到较多的再生苗和转化的大豆植株。本发明采用真空渗透法在外植体上制造微小伤口，充分的提高了农杆菌入侵的机会，明显的提高了农杆菌的感染效率，有效的提高了出芽数量和转化苗的数量。

主权项

1、一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，其特征在于包括如下步骤：1)大豆种子冲洗后放在70％的酒精中浸泡0.5～1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗后将种子置于无菌水中浸泡18～24小时，使种子萌发；2)剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时；3)在0.06-0.08MPa真空压力条件下，农杆菌感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，然后放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天；4)转入MSB+BA0.5mg/L+cb500mg/L(PH5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基；5)转入MSB+BA0.5mg/L+cb500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固体)每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2～3cm；6)切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。