[发明专利]利用侵染相关基因的协同作用提高微生物杀虫效果的方法

摘要

一种利用侵染相关基因的协同作用提高微生物杀虫效果的方法，将虫生真菌侵染昆虫时分泌的两类主要水解酶类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶基因克隆，并将二者分别置于真菌、细菌或植物组成性启动子之下，然后串联于真菌、细菌或植物表达载体上，构建类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶基因的双价表达载体。利用遗传转化技术将双价表达载体分别转入虫生真菌、杀虫细菌或杀虫病毒，获得同时高效表达类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶的重组菌株，使二者在微生物侵染昆虫时协同作用，提高菌株毒力；或者将双价载体转入植物，获得同时表达类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶的转基因植株，使二者在植物中协同作用，提高植株的抗虫能力。

主权项

1、一种利用侵染相关基因的协同作用提高微生物杀虫效果的方法，其特征在于，依次包括下列步骤：(1)球孢白僵菌(Beauveriabassiana)类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因BbChit-1基因克隆①球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的cDNA基因克隆利用昆虫体壁诱导球孢白僵菌分生孢子萌发后的芽管状物，提取RNA，纯化mRNA，构建cDNA文库，同时，根据对不同来源的类枯草蛋白酶基因的同源性比较结果，按其中2个保守序列设计引物，上游引物BbP-1(forwardprimer)的序列为：5′＞tggggtctaggtcgcatctc＜3′；下游引物BbP-2(reverseprimer)的序列为：5′＞gccaggtgcgaaaatgtcaac＜3′，然后利用RT-PCR技术扩增出大小为593bp的类枯草杆菌蛋白酶探针BbP，利用此探针筛选cDNA文库，获得阳性克隆，释放文库，酶切验证，测序验证，获得大小为1557bp的CDEP-1cDNA基因(polyA除外)；②球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的基因克隆根据CDEP-1cDNA5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增CDEP-1的基因组序列，上游引物序列为：5′＞cttcatccagcaagcaaagtc＜3′，下游引物序列为：5′＞gttaaatatacagatcaatgagttttg＜3′；③球孢白僵菌内切几丁酶Bbchit1的分离纯化及序列测定在利用几丁质诱导培养球孢白僵菌的基础上，分离纯化出具有内切酶活性的几丁酶Bbchit1，并进行N’端氨基酸测定，序列为：AGTCATKGRPAGKVLQGYWENWD；④球孢白僵菌内切几丁酶Bbchit1的cDNA的克隆提取利用几丁质诱导的球孢白僵菌总RNA，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，结合下游加接头的Oligo-dT引物，利用3′RACE扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列；⑤球孢白僵菌内切几丁酶基因Bbchit1的克隆根据3’RACE得到的cDNA序列，利用YADE技术扩增Bbchit1的全长基因，用于YADE的线性扩增引物序列为：5’＞ccgtgcttgcgaatgtcg＜3’，指数扩增引物序列为：5’＞ggcaccgtcccagttctc＜3’，以DraI酶切球孢白僵菌的基因组DNA为模板，YADE扩增得到了长为1400bp的片段，连接3’RACE和YADE的产物，得到Bbchit1的全长基因序列；(2)蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因BbChit-1双价载体的构建将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于构巢曲霉(Aspergilliusnidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之下，然后将二者串联于真菌表达载体，构建成双价基因的真菌表达载体，或将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1串联于原核表达系统，构建成双价基因的原核表达载体，或将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于植物组成性启动子如35sCAMV和Nos终止子之下，然后将二者串联于植物表达载体，构建成双价基因的植物表达载体；(3)获得同时超量表达蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1重组微生物或抗虫植物利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入虫生真菌或其它杀虫微生物或植物，筛选获得同时组成性超量表达蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组微生物或抗虫植物。