[发明专利]抗蚜虫转基因小麦高效转化再生体系的建立技术

摘要

本发明提供一种抗蚜虫转基因小麦高效转化再生体系的建立技术，包括小麦胚性愈伤组织和悬浮细胞系的建立技术、小麦细胞转基因技术及抗虫转基因小麦的研制技术。

主权项

1、一种抗蚜虫转基因小麦高效转化再生体系的建立技术，其特征是包括小麦胚性愈伤组织和悬浮细胞系的建立技术、小麦细胞转基因技术及抗虫转基因小麦的研制技术：(1)供试材料：为小麦栽培品种“石4185”、“河农859”、“河农326”等，麦长管蚜采集于田间；(2)表达载体构建：用SalI和SacII内切酶进行双酶切，从pIP840质粒上分离出GNA基因片段(505bp)，插入到pBY505载体的Sma位点上，构建成质粒pBC98，GNA基因位于Act-1启动子的调控之下，选择基因为bar基因构建的pBC98质粒全长7.6Kb，宿主菌为E.ColiDH5a；(3)小麦胚性愈伤组织的诱导与培养：取小麦幼穗，用无菌镊子剥出幼穗，切成0.3-0.5cm长度的小段，或取二核期小孢子(花药)、剥离受粉10-15天的幼胚接种于愈伤组织诱导培养基上，25±1暗培养20-25天，诱导出的愈伤组织3-5周继代一次；(4)胚性愈伤组织细胞转化：利用基因枪法转化小麦细胞，轰击前4小时将愈伤组织接种在高渗培养基上进行预处理；(5)转化后的愈伤组织细胞的培养与再生：基因枪轰击后的细胞16小时后转入继代培养基上，恢复培养7天，取生长状态较好的愈伤组织转到含有除草剂的分化培养基上培养；(6)转基因植株的PCR和Southern杂交分析：为了测定抗小麦转基因植株是否含有整合的GNA基因片段，对叶片染色体DNA进行了PCR和Southern杂交分析；(7)转基因植株抗虫试验：将转化植株的新鲜叶片分别放入试管中，每试管接入蚜虫若虫10头，25℃温室培养，每隔半天取来源于同一编号植株的叶片将之替换，使试管内叶片保持新鲜，做3个重复，培养3-5天后，在成虫尚未繁殖之前，统计试管内虫体死亡的个数。