[发明专利]Vero细胞流行性感冒纯化疫苗的制备方法及其应用

摘要

本发明属于预防用新生物制品新型疫苗领域，涉及一种人用Vero细胞流行性感冒纯化疫苗的制备方法及其制品在预防流感中的应用内容。本发明中制备Vero细胞流感纯化疫苗的方法：在来源于非洲绿猴肾传代的Vero细胞上加入促病毒增殖因子后，分别感染流感甲₁、甲₃和乙型流感病毒，72小时后收集三型病毒，经冻融、切向流过滤去除细胞碎片澄清，超滤浓缩、β－丙内酯灭活、Sepharose4FF柱层析纯化，稀释三型病毒原液，再合并三型病毒液，加保护剂、防腐剂成半成品流感纯化疫苗，然后分装为成品以及对疫苗原液、半成品及成品的检测。本发明的Vero细胞流感纯化疫苗解决了以往生产疫苗采用鸡胚繁殖的生产方法，具有安全有效、抗原含量高、副反应小，质量易于控制、成本低的特点，全程免疫只需接种一次。

主权项

1、Vero细胞流行性感冒纯化疫苗其特征在于：(1)制备该疫苗的先进的Vero细胞培养技术以及用此细胞培养技术将用于制备疫苗的甲1(A/New Caledonia/20/99(H1N1)、甲3(A/莫斯科/10/99(H3N2)和乙型(B/香港/330/2001)流感病毒株在传代的Vero细胞上增殖，获得了高滴度病毒；其病毒效价均达到1∶160以上，具有较好的免疫原性及抗原性。(2)本生产工艺建立了Vero细胞规模化培养技术，比较了各种转瓶培养的最佳条件，选择了简便经济质量易于控制的3L转瓶培养技术用于本疫苗生产。(3)甲1、甲3和乙型流感毒种分别在加入促病毒繁殖因子的Vero细胞上(细胞由美国ATCC引进，中国药品生物制品检定所提供，生产疫苗时所用细胞代数不超过140代)增殖，冻融后收获，合并即为原液，原液经切向流滤过(0.45μm膜板)，Pellicon 100KD超滤浓缩，Sepharose 4FF(BPG柱)纯化，β-丙内酯灭活，再经稀释、除菌，三价配伍，加保护剂、防腐剂为半成品，检定合格后，分装安瓶并进行成品检定，合格后包装成纯化疫苗。半成品检定：a.无菌试验：阴性，合格；b.血凝素含量测定：≥12μg/株/0.5mlc.总蛋白量测定：≤300μg/0.5mld.硫柳汞含量测定：≤0.10mg/ml成品检定：a.鉴别试验：与相应的免疫血清进行单扩试验，各型的血凝素抗原应为阳性；b.无菌试验：阴性(无细菌生长)，合格；c.异常毒性测定：无异常毒性，合格；d.过敏原测定：阴性，合格；e.血凝素含量测定每型均符合标准，均应≥12μg/株/0.5ml；f.残余牛血清含量测定：≤25ng/0.5mlg.细胞DNA含量≤10Pg/0.5mlh.内毒素测定：≤100EU/0.5ml；i.pH值：6.8-7.8；j.装量：0.50ml/支；k.外观：轻微乳白色液体，无异物(4)建立了本疫苗的质量控制标准：特别是抗原量(血凝素)的检定，用单向辐射免疫扩散法检测，各型均不低于12μg/0.5ml。(5)用甲1、甲3和乙型毒株生产和检定已经形成系统化，生产工艺和质量控制稳定而且合理，能确保疫苗产品的质量。(6)使用本生产技术生产的Vero细胞流感纯化疫苗避免了疫苗生产、纯化形成制品时来自人或者动物附加的蛋白质、原材料的污染。比目前我国已上市使用的流感鸡胚疫苗具有更好的免疫效果和安全性，其中包括大大减轻的变态反应等。因而具有良好的社会效益和较大的经济效益。(7)Vero细胞流行性感冒纯化疫苗在预防流感中予以应用，其特征是全程免疫只需一针0.5ml，皮下接种，能产生良好的免疫力。