[发明专利]鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法

摘要

一种鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法，通过比较不同抗冻剂的毒性效应和玻璃化性能，筛选出适宜海水鱼类胚胎的玻璃化液配方；确定适宜玻璃化处理的胚胎发育时期，研制出特定的洗脱溶液，采用分步平衡、快速降温和解冻的技术路线，建立了鱼类胚胎玻璃化冷冻保存技术。对牙鲆不同发育时期胚胎进行了8次玻璃化冷冻实验中共获得冷冻复活胚20粒，最高复活率达32％。其中5次实验中获得冷冻复活胚胎发育孵化出鱼苗的结果。在20枚冷冻复活胚胎中，有14枚冻胚孵化出鱼苗，孵化率高达70％。冻胚孵出的鱼苗，胚体透明，形态正常，无畸形。本发明技术无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，易于推广，可用于牙鲆等海水鱼类胚胎超低温(－196℃)冷冻保存。

主权项

1.一种鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法，其特征在于它的操作技术是，包括鱼类胚胎收集、制备基础液和筛选抗冻剂、配制玻璃化液、胚胎冷冻前的平衡处理、投入到液氮中予以冷冻保存等，之后待需时，予以解冻培育，其鱼类胚胎收集：为体节出现期—出膜前期；玻璃化液配制：是基础液和抗冻剂的混合液，基础液(BS2)为：NaCl 2.472％、KCl 0.086％、CaCl2·2H2O 0.146％、MgCl2·6H2O 0.486％、NaHCO3 0.019％；抗冻剂为：1，2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)；玻璃化液配方是：BS2：50-67％，PG：20-30％，MeOH：13-20％；胚胎冷冻前的平衡处理：将胚胎逐级依次在浓度为25％、33％、50％、67％及100％的玻璃化液中分五次进行平衡处理，处理45-55min，每步9-11min；液氮中速冻保存：将平衡好的胚胎9-13粒连同250ul的玻璃化液吸入到直径3mm、长10cm麦管内，热压封口后，以2000℃/min的降温速率投入到-196℃液氮中速冻保存；解冻和培育：将麦管从液氮中移出，在1-2秒钟时间内快速插入39-40℃水浴中使其迅速解冻，在胚胎乳白色即将消失时，剪开麦管，用2ml 0.125M的蔗糖洗脱液，将胚胎冲入器皿中进行洗脱，时间为10min，之后添加14-16℃灭菌海水进行培育。