[发明专利]一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的制备方法

摘要

本发明涉及一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法，采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶，在带有梯度洗脱并能同时显示紫外和电导参数装置的高、中、低压层析仪上进行；性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物。本发明可以方便、快速地从蛇毒中提取类凝血酶，其纯度和生物活性均可达到药用标准。与传统方法相比较，本发明生产工艺简单，回收率高，活性损失小，并可几乎线性放大到工业规模化生产。

主权项

1.一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的制备方法，其特征在于，采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶，在带有梯度洗脱并能同时显示紫外和电导参数装置的高、中、低压层析仪上进行；性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物；具体步骤如下：1).选用江浙产蝮蛇抗栓酶的等电点在4～5左右，并选择在它的等电点附近酸碱度的溶样液，首先使类凝血酶在溶样液中以阳离子蛋白质形式存在，然后选择一种可以与这样带电蛋白质特异性结合的阳离子交换介质进行梯度洗脱，收集活性峰；2).阳离子交换收集的含有类凝血酶活性的馏分经稀释和调pH值后，上阴离子交换柱，稀释后含NaCl在0.05M以下，pH在8.5左右，阴离子交换层析的A液可选用pH在8.5左右的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，B液为在A液中加入0.6-1.0M左右的NaCl溶液，梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗10个柱体积以上，介质选择商品化的阴离子交换介质，收集阴离子层析后含类凝血酶的活性峰；3).将阴离子交换收集的含类凝血酶的活性馏分直接上凝胶层析，收集含类凝血酶的馏分，流动相选用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS缓冲液，浓度在10mM-50mM之间，用等度洗脱，介质选用商品化的凝胶介质；4)对最后一步的最大活性峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别约为98％和95％，脱盐冻干后可得纯类凝血酶。