[发明专利]一种抗肿瘤免疫活性细胞－DCIK细胞、其制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种抗肿瘤免疫活性细胞－DCIK细胞、其制备方法及应用，主要是利用细胞因子诱导DC和CIK细胞，然后用肿瘤抗原冲击DC细胞，将经抗原冲击过的DC与CIK细胞按一定比例混合进行共培养，得到一种新的免疫效应细胞群，即DCIK细胞。本发明的DCIK细胞与CIK细胞比较，增殖活性和细胞毒活性更强，且表现对恶性细胞的特异性杀伤。上述DCIK细胞主要用于自体瘤治疗，术后即时施治能有效防转移防复发，也可作化学疗法的辅助治疗，此外，DCIK细胞也可用于某些传染性疾病的免疫治疗。

主权项

1、一种DCIK细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：一、PBMC的制备取肿瘤病人抗凝外周血20～50ml，生理沿水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液以分离PBMC，分离所用离心机之转头为水平转头，离心速度为2000rpm，离心20～25分钟，然后用Hanks平衡液洗涤PBMC2次，再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液AIM-V调节细胞密度成3～5×106/ml的细胞悬液；二、PBL和粘附细胞的分离将细胞悬液移入6孔板，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱温育2小时，然后用移液管轻轻冲吸细胞，将非粘附PBL悬液收集在离心管中，6孔板中留下的粘附细胞作诱导DC用；三、CIK细胞的诱导和扩增在上述PBL悬液中添加重组人IFN-γ终浓度为1000u/ml，然后移入培养瓶中，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中温育24小时，之后，每瓶添加鼠抗人CD3单克隆抗体，IL-1和IL-2，终浓度分别为50ng/ml，100u/ml和500u/ml；或者采用固相CD3单抗刺激的方法，即将全部细胞悬液移入CD3单抗包被过的培养瓶中，再添加IL-1和IL-2，终浓度分别为100u/ml和500ug/ml。继续培养48～72小时后显微镜下细胞计数，然后用CIK细胞培养液调节细胞密度为3×105/ml，分配到25cm2培养瓶中，进行扩大培养，此后，每隔48或72小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第8天时收集CIK细胞待用；四、DC诱导和扩增在前述留有粘附细胞的6孔板中加入DC培养液，37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养5天，然后在各孔添加自体瘤细胞裂解液，使裂解液蛋白终浓度为10-50ug/ml，继续培养2～3天后，用移液管冲吸和收集非粘附和半粘附性DC细胞待用；五、DC与CIK细胞共培养制备DCIK细胞培养7～8天的DC和CIK细胞，分别计数，离心弃上清后，分别用CIK培养液调节细胞密度为6×105/ml和2×105/ml，等体积混合后移入培养瓶中，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每隔48～72小时按4×105/ml的起始细胞密度分瓶扩大培养一次。