[发明专利]dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法

摘要

本发明涉及一种dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法。本发明通过RT－PCR获取目标病毒基因组中某一基因的全长或部分核苷酸序列的cDNA，并分别插入到含有内含子的pBlueSK的两端，构建该基因片段的反向重复，继而将含有内含子的反向重复片段插入到植物表达载体pBIN438上，重组载体通过三亲交配的方法导入农杆菌菌株，获得农杆菌介导的植物抗病毒载体。该载体经农杆菌介导法转化烟草叶盘，对所得转基因植物进行供体病毒和相关病毒的抗性检测表明，使用本发明所获载体转化植株后可获得对相应植物病毒免疫的植株。

主权项

1.一种dsRNA介导的植物抗病毒基因工程的方法，其特征在于它的步骤为：1)以RNA为模板，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增目标基因；2)将目标基因克隆至pGEM-T或pGEM-TEasy或pUCm-T载体上；3)在载体上酶切目标基因分别插入至含有内含子的pBlueSK的两端，构建反向重复克隆；4)将pBlueSK上含有内含子的反向重复片段切下，插入至植物表达载体pBIN438，并将重组植物表达载体导入大肠杆菌细胞；5)通过三亲交配的方法把大肠杆菌细胞中带有反向重复片段的植物表达载体pBIN438通过三亲交配的方法导入农杆菌EHA105；6)将含有pBIN438上的农杆菌菌液与50-200倍不含任何抗生素的MSs液体培养基混匀，将所得菌液进行叶盘转基因，并获得转基因植株；7)利用Southernblot和供体病毒及相关病毒对转基因植株的攻毒分析获得单拷贝的免疫的转基因植株。