[发明专利]转基因农产品及食品混合物的定量检测的方法

摘要

本发明涉及转基因农产品及食品混合物的定量检测的方法。该方法包括以下步骤：转基因农产品及食品混合物基因组DNA的提取；检测标记基因和看家基因引物和探针的设计；确定定量检测样品的标准曲线；实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测、定量分析。本发明的方法使用实时荧光定量PCR仪器对检测的过程能够进行实时监测，可以保证检测数据更加精确，同时由于检测数据即标准曲线的制作和样品的定量都采用计算机软件自动完成，因此可以保证数据的不可更改性和正确性。

主权项

1.转基因农产品及食品混合物的定量检测的方法，其特征在于包括以下步骤：第一步、转基因农产品及食品混合物基因组DNA的提取对于液态待测样品，采用冷冻干燥法干燥并磨碎成粉末状；对于非粉末状的固体待测样品，采用研磨处理成粉末状，然后提取样品的基因组DNA；第二步、针对转基因检测标记基因和看家基因设计引物和探针1)从ncbigenbank数据库中得到转基因检测标记基因和植物或农产品的看家基因，其中检测标记基因主要包括CAMV35S启动子、NOS终止子、Kmr(抗卡那霉素基因)、Neor(抗新霉素基因)、Kygr(抗潮霉素基因)、Barr(抗草丁膦基因)、NPT-II(新霉素磷酸转移酶基因)、人工插入植物基因组改变农产品及食品品质和功能的特异的外源基因；2)针对从ncbigenbank数据库中得到转基因检测标记基因和植物或农产品的看家基因的保守区域设计引物和Taqman探针，使设计的引物和探针满足如下条件：(1)标记基因和看家基因标记的报告荧光具有不同的发射波长(2)标记基因和看家基因的引物和探针可以在同一管中反应；3)在DNA合成仪器上合成上述设计的引物和探针；第三步、确定定量检测样品的标准品选定我国政府承认的转基因定量检测的标准品，或者按照以下步骤得到标准品：1)设计标准品的引物，使该引物扩增出来的片段包含定量检测的标记基因或者看家基因片段，长度在100bp～400bp之间；2)将上述设计的标准品引物100～400nmForwardPrimer，100～400nmReversePrimer和1×PCRBuffer，1.5～6mMMgCl2，100～400μMDntp(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1～100ng含有转基因检测标记基因或看家基因的基因组DNA，0.5U～5UAmpliTaqDNApolymerase置于pcr反应管中，用重蒸水补至50微升，进行聚合酶链式反应，聚合酶链式反应(PCR)反应条件：94℃预变性2分钟，再反应25～35个循环，每个循环包括：94℃变性30秒～1分钟，45℃～67℃退火30秒～1分30秒，72℃延伸30秒～1分30秒，循环结束后，继续进行72℃延伸反应5分钟；3)将上述PCR产物进行凝胶电泳，将目的片段割胶回收，回收的片段连接到质粒载体中，然后将此重组质粒转化到大肠杆菌中，让重组质粒在大肠杆菌中大量表达，再将重组质粒DNA提取并纯化，获得大量的重组质粒；4)利用质粒载体上限制性内切酶位点对重组质粒进行酶切，再利用DNA测序仪器测序鉴定经过酶切鉴定含有目的片段的重组质粒，确定经过重组后的质粒含有完全正确的目的片段；5)计算含有完全正确目的片段的重组质粒浓度，将含有标记基因和含有看家基因重组质粒的浓度按照0～100％的比率混合，取其中至少四个比率作为实时荧光定量PCR转基因检测的标准品；第四步、实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测将1×PCRBuffer，1.5～6mMMgCl2，100～400μMdNTP(dATP，dCTP，dGTP)，400μMdUTP，100～900nm第二步所得标记基因ForwardPrimer和ReversePrimer，50～300nM第二步所得标记基因Taqman探针，100～900nm第二步所得看家基因ForwardPrimer和ReversePrimer，50～300nM第二步所得看家基因Taqman探针，10～100ng样品基因组DNA，0.01～0.05UAmpEraseUNG酶，0.5～5UAmpliTaqGodDNApolymerase，置于同一pcr反应管内，用重蒸水补至50微升，利用多通道实时荧光定量PCR仪器对样品和标准品的标记基因和看家基因进行实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和检测；聚合酶链式反应(PCR)反应条件：37℃反应5～15分钟，95℃预变性5～15分钟，再反应25～45个循环，每个循环包括：94℃变性30秒～1分钟，45℃～67℃退火30秒～1分30秒，72℃延伸30秒～1分30秒，循环结束后，继续进行72℃延伸反应5分钟；第五步、定量计算分析1)标准品的定量和标准曲线的确定从实时荧光定量PCR仪检测软件中得到标准品的检测标记基因和看家基因的Ct数值，将标准品中检测标记基因和看家基因的比率作为横坐标，标准品中检测标记基因和看家基因的Ct值差值的绝对值为纵坐标，以第三步中5)所取的标准品的标记基因重组质粒和看家基因重组质粒浓度的四个比率和每个比率对应的检测标记基因和看家基因的Ct值差值的绝对值制得一条直线，利用线性回归统计分析将该直线拟合成y＝-Klog(x)+B，式中-K为这条直线的斜率，B为常数，以该直线作为转基因检测标准曲线，式中y是检测标记基因和看家基因Ct值差值的绝对值，x是检测标记基因和看家基因的比率；2)样品的计算和定量从实时荧光定量PCR仪检测软件中得到样品的检测标记基因和看家基因的Ct值，取同一样品的检测标记基因和看家基因的Ct值差值的绝对值，作为y数值代到转基因检测的标准曲线公式y＝-Klog(x)+B，得到的x值就是检测标记基因和看家基因的比率，也就是此转基因农产品或食品的转基因率。