[发明专利]一种高效生物除草菌剂的制备方法及用途

摘要

本发明公开的高效生物除草菌剂的制备方法，其菌种筛选工艺中采用从反枝苋、马唐、藜、千金子、决明等杂草根际5－15cm土壤、地上茎、叶片取样，分离时用NPC培养基、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)生长抑制试验和谷氨酰胺合成酶抑制剂筛选模型，选择除草生物活性高、杀草谱广的菌株。经测定，其菌剂对目前田地内大部分阔叶杂草和部分主要禾本科杂草有较好的防除效果，茎叶喷雾处理对反枝苋、藜、决明、蓼的防效达90％以上，对早熟禾、马唐、千金子的防效分别达75％、85％、80％。并对大部分草坪草和苗木安全。

主权项

1.一种高效生物除草菌剂的制备方法，其特征是包括以下步骤：1)从反枝苋、马唐、藜、千金子、决明等杂草根际5-15cm土壤、地上茎、叶片取样，在200ml无菌水中漂洗1-3次，投入100ml0.01-2.0％吐温-80溶液中400-600rpm摇瓶10min，用无菌磷酸盐缓冲液(5-20MmK3PO4-KH2PO4，0.05-2MNaCl，PH6.4-8.2)作10-20倍系列稀释，取0.1-0.3ml涂布于NPC培养基平板，20-32℃培养20-30h观察结果，挑选有色的菌落，保存于营养琼脂上，对初筛出的单菌落作进一步分离纯化：①抑菌试验，用接种针接一环待测菌，穿刺接种到大肠杆菌平板，20-32℃培养箱培养20-30h，观察抑菌斑；②蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)生长抑制实验，将藻液接种到锥形瓶中，初始浓度为8×103-8×106个细胞/ml；处理加入待测液，对照不加，20-30℃、3000-6000lux光照度持续光照和100-200rpm旋转振荡培养2-7d，以培养液为参比，在最大吸收波长680nm下测定吸光值(光程1cm)，测抑制率；③谷氨酰胺合成酶抑制剂模型筛选，分别在没有添加谷氨酰胺和添加了浓度为0.05-10％的谷氨酰胺的常规培养基上涂枯草芽孢杆菌细菌悬液平板，观察抑菌效果，从中选出菌落生长快，抑菌效果好，生物活性高的菌株。2)菌株在常规固体培养基中进行斜面培养，复壮，25-30℃培养9-24h；然后进行种子培养，在400ml三角瓶中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方为：牛肉膏0.5-2.2％，蛋白胨0.2-4％，葡萄糖0.2-4％，NH4H2PO40.05-0.5％，NaCl0.1-2.0％，以水补足体积；调初始PH6.0-7.4，在121-125℃下灭菌20-30min，冷却后以1％的接种量接种，25-30℃培养12-32h。3)发酵罐中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方同种子液体培养基的配方，以6-12％的接种量接种，通气量为1∶0.6-1.5(V∶V)，25-30℃培养54-120h；菌发酵液中含菌量在105-9cfu/ml；添加助剂，助剂为0.5-5％吐温80或氨硅，得到除草菌剂；