[发明专利]表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法

摘要

本发明公开了传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因马铃薯的生产方法。传染性支气管炎病毒纤突蛋白基因插入到植物表达载体pBI121上，经三亲交配的方法把重组表达载体导入农杆菌中，外源基因经农杆菌介导法转化马铃薯茎段，通过再生植株的抗生素抗性筛选和PCR、Southernblot及Northernblot等分子分析，获得表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因植株。用这些表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因植物直接饲喂鸡或用转基因植物中纯化出的传染性支气管炎病毒纤突蛋白作为注射剂注射给药的方式免疫鸡，引起了鸡对该抗原蛋白的免疫应答反应，说明转基因表达产物具有良好的免疫原性，为转基因植物生产传染性支气管炎疫苗打下基础。

主权项

1.一种表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法，其特征在于它的的步骤如下：1)传染性支气管炎病毒S1或S蛋白抗原基因的植物表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S构建：以传染性支气管炎病毒毒株核酸为模板，PCR扩增获得传染性支气管炎病毒S1或S基因被直接定向插入到质粒pBlueScriptSK(+)中的相应位点内，得到质粒pBSIBV/S1或pBSIBV/S，然后pBSIBV/S1或pBSIBV/S用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切可将S1或S基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得该DNA片段，随后插入到质粒pBI121GUS基因位点上(XbaI和BamHI双酶切)便构建成双元表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S。2)表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S经三亲交配法导入到具有较强感染能力的农杆菌菌株EHA105中；3)农杆菌介导的植物遗传转化：农杆菌介导的植物遗传转化是将经过预培养的马铃薯无菌苗外植体与含有表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S的农杆菌EHA105共培养后在抗性愈伤组织诱导的培养基上诱导形成抗性愈伤组织，抗性愈伤组织在分化培养基上分化出抗性芽，抗性芽生根培养基上生根发育成完整的再生植株。4)用PCR、Southern-blot、Northern-blot确定转基因植株；5)不同转基因马铃薯植株传染性支气管炎病毒纤突蛋白含量的测定：用ELISA方法测定转基因马铃薯植株传染性支气管炎病毒纤突蛋白含量，获得表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因植株；6)表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因植物的田间繁殖和培育。