[发明专利]罗氏沼虾病毒复合反转录多聚酶链反应检测的方法

摘要

本发明公开了一种罗氏沼虾病毒复合反转录多聚酶链反应检测的方法，其步骤是：首先设计两种病毒的特异引物；其次是组织RNA提取；第三是反应体系；第四是扩增体系。本发明灵敏度高，检测时间短，可以同时检测两种病毒，适合于罗氏沼虾肌肉白浊病的病原诊断及亲虾、幼苗和成虾的健康监测。

主权项

1、一种罗氏沼虾病毒复合反转录多聚酶链反应检测的方法，包括下列步骤：(1)设计病毒特异引物，诺达病毒上下游引物：ggtagttcccgaagcaaatgtag，cactcttaacccccactcctg；小病毒上下游引物：atgcagccgggtggtaatg，tgtgcagctggtggataaagaata；(2)组织总RNA提取：称取10-50mg的病虾苗或成虾组织，用1ml样品处理液，研磨，3000g离心10min，取上清加入0.2ml的氯仿，混合30秒，12000g离心10分钟，取水相0.6ml加入0.5ml的异戊醇混匀，放置10分钟，12000g离心10分钟，75％乙醇洗2次，干燥后用焦碳酸二乙酯处理的双蒸水溶解；(3)反应体系：在50μl反应体系内，加入4μl10mMdNTP，2.5μl100mMDTT，1μlRNA酶抑制剂5U/μl，10μl5x反转录多聚酶链反应buffer，2μl的上下游引物，1μl酶混合物，底物为从组织提取的总RNA；(4)扩增条件：55℃30min，1个循环；94℃，30s，55℃30s，72℃1min30s，30个循环，72℃7min，1个循环，1.5％琼脂糖电泳检查扩增产物，扩增产物为罗氏沼虾诺达病毒反转录多聚酶链反应扩增序列和罗氏沼虾15nm病毒反转录多聚酶链反应扩增序列。