[发明专利]复合多聚酶链－酶联免疫反应检测对虾病毒的方法

摘要

本发明公开了一种复合多聚酶链－酶联免疫反应检测对虾病毒的方法。其步骤：首先是捕获探针和扩增引物的设计与合成；其次是组织总核酸提取；三是复合多聚酶链反应标记地高辛；四是固相杂交；五是酶联显色。本发明具有高度的特异性和灵敏性，操作简单，可批量检测样品，适合于对虾白斑综合征病毒、桃拉综合症病毒和肝胰腺细小病毒的诊断以及亲虾、幼苗和成虾的健康状态监测。

主权项

1、一种复合多聚酶链-酶联免疫反应检测对虾病毒的方法，包括下列步骤：(1)特异性寡核苷酸探针和扩增引物的设计和筛选：根据病毒基因组序列设计，对虾白斑综合征病毒、桃拉综合症病毒和肝胰腺细小病毒末端标记生物素的捕获探针序列为：生物素-ACTGTCACTGTTGCT；生物素-AGTTAGAACGGATAG；生物素-AGCAAGGTAGAGCTG，扩增白斑综合征病毒的上下游引物序列为：TGATTTGTTGTGCCCTTTTG，ACGTAGGGTCGATGTTGGTG；扩增肝胰腺细小病毒的上下游序列为：ACACAGCAATATGATCAAGAGAAA，GCACTGGCCATCGTATCTT；扩增桃拉综合症病毒的上下游引物序列为：TCGCTGCATGAGAAGGGTTAT，TTTTCGATGCAGATGGGTAAC；(2)组织总核酸提取：取感染对虾组织，匀浆后加裂解液和蛋白酶K，55℃温浴1h，间隔10min摇动一次，冰浴3-5min后以12000g离心10min，取上清加预冷的异丙醇，-20℃放置30min后以12000g离心15min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后以焦碳酸四乙酯处理的双蒸水重悬沉淀；(3)复合多聚酶链反应标记地高辛：取对虾病毒总核酸粗制品，加入桃拉综合症病毒下游引物TTTTCGATGCAGATGGGTAAC，70℃温浴5min，冰浴5min后依次加入反转录缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂和反转录酶，补充焦碳酸四乙酯处理的双蒸水至总体积为25μl，42℃温浴1h，对虾病毒核酸在扩增过程中标记上地高辛，整个标记扩增体系在50μl反应体系内进行，含有反转录产物作模板，一倍的多聚酶链反应缓冲液，一倍的地高辛标记dNTP混合物，对虾病毒特异性的扩增引物混合物和Taq酶，反应循环为94℃ 30S、53℃ 30S，72℃1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min；(4)寡核苷酸探针的固相化：固相杂交反应用包被好链亲和素的96孔微孔反应板，末端标记上生物素的捕获探针经生物素-链亲和素桥锚定在微孔板上，对虾病毒的捕获探针以含牛血清白蛋白的磷酸缓冲液稀释，22-25℃温浴30-60min，以含牛血清白蛋白的磷酸缓冲液浸泡洗板，4℃保存备用；(5)固相杂交：取扩增产物热变性10min，冰浴3-5min，加至结合有特异性寡核苷酸捕获探针的微孔反应板中，并加杂交缓冲液，混匀后于25℃温浴1-2h，用含吐温-20的磷酸缓冲液洗板；(6)酶联显色：杂交后，以牛血清白蛋白的磷酸缓冲液稀释耦连有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体，加至各反应孔中，37℃温浴30-60min后以含吐温-20的磷酸缓冲液洗板，以对硝基苯磷酸酯作为底物，以Tris盐酸缓冲液稀释，避光显色30-60min，以氢氧化钠终止反应；(7)结果判定：肉眼观察，显色黄色为阳性。