[发明专利]不育转基因鱼的制备方法

摘要

本发明公开了一种不育转基因鱼的制备方法，以鲤鱼肌动蛋白基因启动子作为启动子，以反义的286bp鲤鱼鲑鱼型促性腺激素释放激素基因互补脱氧核糖核酸片段[包括sGnRH十肽、促性腺激素释放激素相关肽编码区和64bp的3′非编码区序列]为靶位基因，草鱼生长激素基因3′侧翼序列为终止顺序，构建鲑鱼型促性腺激素释放激素反义RNA表达载体，采用显微注射法将重组DNA片段导入鲤鱼受精卵，聚合链式酶反应及放射免疫检测筛选获得不育转基因鱼。本发明方法易行，操作方便，为解决转基因鱼的遗传和生态安全问题提供了具有普遍适用性的技术平台。

主权项

1、一种不育转基因鱼的制备方法，包括下列步骤：A、鲑鱼型促性腺激素释放激素反义RNA表达载体的构建，在鲑鱼型促性腺激素释放激素反义RNA表达载体中，以鲤鱼肌动蛋白基因的启动子2.5kb片段为启动子，按3′-5′的方向，286碱基对鲤鱼鲑鱼型促性腺激素释放激素基因的cDNA片段为靶位基因插入在启动子的下游，随后以草鱼生长激素基因的3′侧翼顺序0.8kb为终止顺序，反义载体骨架为pUC118；B、转基因鱼的制备，将鲑鱼型促性腺激素释放激素反义RNA表达载体分别用限制性内切酶消化，得到线性重组DNA片段，回收的DNA溶于缓冲液，调节其终浓度为50ng/μL，鲤鱼受精卵用0.25％的胰蛋白酶消化去除卵膜，采用显微注射的方法，在第一次卵裂前将DNA溶液导入受精卵动物极，DNA注射剂量约5×105拷贝/卵，完成显微操作后的受精卵置于实验室无菌环境中孵化；C、不育转基因鱼的筛选，剪取转基因鱼尾鳍，提取DNA，采用PCR技术检测转基因阳性鱼；从转基因阳性鱼尾部血管取血，检测转基因阳性鱼血清中11-酮基睾酮的浓度，确定雄性鲤鱼，同时采用双抗体放射免疫法测定血清的促性腺激素含量，其血清促性腺激素含量低于同批转基因阳性鱼促性腺激素含量的60％，则筛选获得不育的转基因鱼，正向检测引物为5′-CCATGGCGTATCGATGTCGAC-3′位于启动子与反向靶向序列之间的接头序列上，反向检测引物为5′-CATGGCTTTGCCAGCATTGG-3′位于靶向序列上，两引物扩增的片段长度为328bp。