[发明专利]牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法

摘要

本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法，主要经由抗原预包被条制备、酶结合物制备、其它试剂的配制、检测。利用辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG以检测已与固相牛病毒性腹泻病毒抗原结合的受检牛病毒性腹泻病毒抗体。其检测方法特异性高，操作方便，通过可增敏的惰性蛋白和酶结合物增敏剂的使用，大幅度提高了灵敏度和检出率，降低了抗原和酶结合物的用量，相应地也降低了成本，检测时间短，2小时内即可完成检测操作。其方法操作简便易行，可以标准化为产品，可以用于大批量检测，做到每头牛检测，也可以用于流行病学调查和主动免疫效果检测，以及辅助检测牛病毒性腹泻病毒。

主权项

1.牛病毒性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法，经以下检测方法进行，抗原预包被条制备→抗体酶结合物制备→其它试剂的配制→检测，其特征在于：(1)抗原预包被条制备：经由包被、封闭、保护、干燥过程a.包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将病毒抗原或重组抗原稀释为0.1～10.0μg/ml，按100μl/孔加于聚苯乙烯微孔板中，放置、甩干；b.封闭：按150μl/孔用含0.1％～20.0％惰性蛋白即蛋白胨，pH6.5～8.0的磷酸盐缓冲液封闭、甩干；c.保护：按100μl/孔用含20％蔗糖，pH6.5～8.0的磷酸盐缓冲液室温保护3小时；d.干燥：置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装中保存；(2)酶结合物制备：经由酶标记、酶工作液配制过程1)酶标记a.HRP的活化：用三蒸水配制HRP(RZ≥3.0)溶液，加入过碘酸钠溶液，2℃～8℃避光1小时；加入乙二醇，2℃～8℃反应28～32分钟；加入pH4.4的醋酸盐缓冲液2℃～8℃透析过夜，换透析液两次；b.标记：将上述活化酶加抗体，加入纯化的兔抗牛IgG中，用pH9.5的碳酸盐缓冲液调节pH至9.2，2℃～8℃反应20小时；c.还原：将硼氢化钠溶液加入前述反应混合物中，2℃～8℃反应2小时；结合物加入pH6.0的磷酸盐缓冲液2℃～8℃透析过夜，换透析液两次，加对倍中性甘油后-20℃保存；2)酶工作液配制a.缓冲液配制：以三蒸水配pH6.5～pH8.0的磷酸盐缓冲液，内含0.1％～5.0％增敏剂聚乙二醇；0.1％～20.0％蛋白胨；0.5‰酶保护剂；0.5‰硫柳汞钠及以1‰吐温-20；b.以所配的缓冲液，按适当浓度稀释冻存的标记酶；(3)其它试剂的配制1)洗涤液：本方法采用固体洗液，有商品洗液出售；2)样品稀释液：以三蒸水配内含0.1％～20.0％蛋白胨的pH7.4磷酸盐缓冲液；3)显色剂A：以三蒸水配pH5.0醋酸盐缓冲液，内含0.5‰过氧化脲；4)显色剂B：用甲醇配1.6‰四甲基联苯胺，溶解后对倍加甘油；5)终止液：以三蒸水配2M硫酸溶液；6)阳性对照：取筛出的阳性血清(OD450nm≥0.500)加少量红色染料并按1000单位/ml加青霉素和链霉素，无菌过滤；7)阴性对照：取筛出的阴性血清(OD450nm≤0.100)，按1000单位/ml加青霉素和链霉素，无菌过滤；(4).检测1)将一包固体洗液加500ml蒸馏水溶解后即为洗涤液；2)取抗原预包被条，每孔各加100μl样品稀释液，再加1-20μl待测标本血清，同时设空白(只加100μl样品稀释液)、阴性对照(加100μl，不加样品稀释液)、阳性对照(加100μl，不加样品稀释液)，37℃孵育20～60分钟后，甩干；3)用洗涤液洗涤6遍，甩干；4)加1滴前述的酶结合物工作液(空白不加)，37℃孵育20～60分钟后，甩干；5)用洗涤液洗涤遍，甩干；6)依次加1滴显色剂A和1滴显色剂B，37℃避光孵育10分钟；7)加1滴终止液，酶标仪检测OD450nm。