[发明专利]一种抗酵母类真菌抗生素的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种抗酵母类真菌抗生素的快速检测方法。应用美蓝—酶联免疫检测仪快速测定抗酵母类真菌抗生素。其原理是：活的酵母，由于新陈代谢不停地进行，能将无毒的美蓝还原脱色成无色，但死酵母无此还原力。抗生素与酵母作用后，通过酶联免疫检测仪检测吸光度的变化，可反映抗生素的活性。具体步骤包括将抗生素稀释、种板、抗生素与靶菌液共同作用、酶联免疫检测仪测定空白板吸光值、加入美蓝染液、保温、酶联免疫检测仪测定吸光值，最后进行数据处理。本发明具有准确，快速，方便，经济等优点。可应用于抗酵母类真菌抗生素的研发过程中，特别是初筛阶段。同时可用于定量分析，便于进行抗生素合成和分离纯化过程中的活性检测以及产品质量标准的建立。

主权项

1、一种抗酵母类真菌抗生素的快速检测方法，它包括将靶菌液稀释、抗生素稀释、种板、抗生素与靶菌液共同作用、酶联免疫检测仪测定空白板吸光值、加入美蓝染液、保温、酶联免疫检测仪测定吸光值、最后进行数据处理，其步骤是：(1)将培养14-20h的白色念珠菌(Candida albicans)用YPD培养基稀释至1～5×105 CFU/mL，在无菌的96孔板的第1列各孔中加入YPD培养基200μL为空白对照，从第2列到最后1列每孔中加入稀释好的靶菌液100μL，除最后1列再加入100μL YPD培养基做生长对照外，其余各孔都加入无菌待测样品100μL，每个样品做三个重复；将板于室温振荡培养20-24h，于酶联免疫检测仪检测各孔的OD630(记为A0)，在每孔中加入美蓝染液20μL，使其终浓度为0.05-0.1‰，室温下静置保温10-20min，于酶联免疫检测仪检测各孔的OD630 (记为A)；(2)制备美蓝染液：配制美蓝A液和B液，所述的A液是将5g美蓝溶于100mL95％的酒精中配制成美蓝酒精饱和溶液；所述的B液是配制成0.01％的KOH水溶液，将A液30mL和B液100mL混匀，过滤；(3)制备YPD培养基，其配制比例如下：葡萄糖2％，胰蛋白胨2％，酵母粉1％，pH5.0～5.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；(4)定性检测：以吸光值A-A0作为最终OD630，该OD630值大于1小于2时定为有抗酵母类真菌的活性；(5)定量检测：取无菌96孔板，于每一行第一列加入YPD 200μL作为空白对照，从第二列起直到最后一列加入稀释成105CFU/mL的Candida albicans靶菌液，每一行加入同一稀释度的靶菌液，再从第二列起直到倒数第二列加入标准抗生素如氟康唑100μL，每一列加入同一稀释度的标准抗生素氟康唑，使其终浓度依次为128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，最后一列加入YPD培养基100μL，作为生长对照孔；做三个重复；用上述测定方法测定OD630(A-A0值)，以抗生素浓度为横坐标，OD630为纵坐标制作标准曲线；待测样品按同样条件操作，根据OD630 从标准曲线上求得相应的浓度。