[发明专利]哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的制备工艺

摘要

哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的制备工艺，根据人源性U6启动子的序列进行引物设计，以HepG2细胞的基因组DNA为模板扩增目的基因得到PCR产物，将PCR产物经XbaI和KpnI酶切后，与同样经XbaI和KpnI酶切的pUC18在T4连接酶作用下连接，连接产物转化大肠杆菌XL－10gold株，以质粒纯化试剂盒纯化重组质粒，用XbaI和KpnI酶切鉴定，挑选酶切鉴定阳性的质粒测序，序列测定采用双脱氧链末端终止法，构建哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体pUC18U6，本载体可以在哺乳动物细胞内表达小干扰核糖核酸，抑制相应基因的表达，从而可以用于研究相应基因的功能；抑制病毒基因、癌基因等致病基因的表达，则可用于治疗病毒性疾病和肿瘤等疾病。

主权项

1、一种哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的制备工艺，其特征在于：1)根据人源性U6启动子的序列进行引物设计正向引物：5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物：5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有XbaI和KpnI酶切位点；2)扩增目的基因用胰酶消化处于对数生长期的HepG2细胞在800-1000rpm转速下离心3-5分钟，收集2×106-5×106个细胞；以200μL的磷酸盐缓冲液重悬收集的细胞，再依次加入20μL的蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissueKit缓冲液AL，震荡混匀，在70℃下放置10分钟，再加入200μL浓度为96％-100％的乙醇，震荡混匀后，加入到DNeasyTMTissueKit离心柱中，在8000-10000rpm转速下离心1-2分钟后，再次加入500μL的DNeasyTMTissueKit缓冲液AW1，以8000-10000rpm转速下离心1-2分钟，加入500μL的DNeasyTMTissueKit缓冲液AW2，在13000-14000rpm转速下离心3-5分钟，将DNeasyTMTissueKit离心柱放到一个干净的1.5mL-2mL的离心管中，加入200μL的DNeasyTMTissueKit缓冲液AE，室温下放置1-3分钟，在8000-10000rpm转速下离心1-2分钟，再向DNeasyTMTissueKit离心柱中加入200μL的DNeasyTMTissueKit缓冲液AE，室温下放置1-3分钟，在8000-10000rpm转速下离心1-2分钟，得到HepG2细胞的基因组DNA；在PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×PCRBuffer、3μl浓度为25mmol/L的MgCl2、4μl浓度为2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2细胞的基因组DNA和30μl的纯水，在94℃延伸5分钟后，于94℃延伸30秒、55-65℃延伸30秒、再于72℃延伸1-10分钟，共循环25-40次，然后在72℃延伸7-10分钟，得到PCR产物；3)哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的构建与鉴定将PCR产物经DNAFragmentPurificationKit纯化回收，纯化的PCR产物经XbaI和KpnI酶切后，与同样经XbaI和KpnI酶切的pUC18在T4连接酶作用下连接，连接产物转化大肠杆菌XL-10gold株，以质粒纯化试剂盒纯化重组质粒，用XbaI和KpnI酶切鉴定，挑选酶切鉴定阳性的质粒测序，序列测定采用双脱氧链末端终止法，以ABI377DNA自动序列测定仪进行，构建成功的哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体命名为pUC18U6。