[发明专利]一种提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法

摘要

本发明“一种提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法”，属于生物技术领域。专用于对病原细菌进行检测。以梨火疫病菌为靶标细菌，包括病植物原细菌特异性抗血清的制备；PCR反应管的包被；PCR反应管的洗涤；样品中目标细菌的吸附；PCR扩增程序。该技术可以稳定地从纯菌、混合菌液和发病样品中扩增出病原细菌的目标片段，排除了样品中PCR抑制物质的干扰，使检测灵敏度(直接检测样品)提高了1000倍。为提高PCR技术检测病原细菌的灵敏度提供了简便、廉价和高效的技术方法。

主权项

1、一种提高PCR技术检测植物病原细菌灵敏度的方法，包括：1)病原细菌特异性抗血清的制备利用传统的抗血清制备方法，用戊二醛固定的细菌全菌体或提取并纯化的细菌脂多糖，免疫家兔，制备抗植物病原细菌全菌体或脂多糖(LPS)的专化性抗血清(技术方法成熟，可参考相关文献)，琼脂双扩散方法(ODD)测定效价，选择效价达到或超过1∶32的抗血清；2)PCR反应管的包被配制包被缓冲液：Na2CO31.59g；NaHCO32.93g，加蒸馏水至1000ml，pH9.6选取没有经过硅烷化的薄壁PCR反应管(普通PCR管)，用包被缓冲液将抗血清稀释500倍，每管加入50μl稀释抗血清，37℃孵育2小时或4℃过夜；3)PCR反应管的洗涤配制0.01MPBST溶液：NaCl8.0g；Na2HPO42.9g；KH2PO40.2g；KCl0.2g；Tween-200.5ml；加蒸馏水定容至1000ml用灭菌的0.01MPBST溶液洗管三次，每次加入100μl，每次五分钟，最后一次加入100μl的灭菌水，甩干；4)样品中目标细菌的吸附配制0.01MPBS溶液：NaCl8.0g；Na2HPO42.9g；KH2PO40.2g；KCl0.2g；定容至1000ml每克植物材料加2ml灭菌的0.01MPBS溶液，制备待测样品悬液；将制备的样品悬液加入包被过的PCR反应管中，每管50μl，37℃孵育2小时或4℃过夜，用灭菌的0.01MPBST洗管二次，每次加入100μl，每次五分钟，最后一次加入100μl的灭菌水，甩干，直接用于免疫吸附PCR扩增。