[发明专利]一种建立小鼠全基因组突变ES细胞库的方法

摘要

本发明提供了一种利用双向双选择基因捕获技术建立大规模的突变小鼠胚胎干细胞库的建立方法。它包括步骤：(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述基因捕获载体从5′至3′的结构是：SA－ST－DS－S1－P1－P2－S2－pA－P3－S3－SD－Ap－TS－AS；(b)筛选带有筛选基因标记的胚胎干细胞；和(c)合并带有筛选基因标记的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。本发明还提供了突变基因位点的鉴定方法。本发明方法为大规模、高通量获取基因突变小鼠奠定了基础。

主权项

1.一种建立大规模突变胚胎干细胞库的方法，其特征在于，包括步骤：(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是： SA-ST-DS-S1-P1-P2-S2-pA-P3-S3-SD-Ap-TS-AS式中：SA是RNA剪接的受体序列；ST是正向串联终止密码子；DS是反向RNA剪接的供体序列；S1是反向的第一筛选基因，选自下组：潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；P1是反向的第一启动子，P2是正向的第二启动子；S2是正向的第二筛选基因，选自下组：潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、或嘌呤霉素抗性基因Puro；pA是正向RNA加尾信号序列；P3是正向的第三启动子；S3是正向的第三筛选基因，选自下组：潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；SD是RNA剪接的供体序列；Ap是反向RNA加尾信号序列；TS是反向三联终止密码子；AS是反向RNA剪接的受体序列；P1、P2和P3是分别选自下组的启动子：CMV、PGK、LTP、或hsv-TK；条件是S1，S2和S3各不相同、且S1和S3中一个筛选基因是绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；(b)筛选带有筛选基因标记的胚胎干细胞；(c)合并带有筛选基因标记的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。