[发明专利]纳他霉素的制备方法

摘要

纳他霉素的制备方法属于以褐黄孢链霉菌为菌种，发酵法生产、提取纳他霉素的技术。本发明解决了生产纳他霉素使用国外培养基、在国内难以买到、并且价格较高及从发酵液提取纳他霉素工艺复杂、费用昂贵或有副产物的问题。提供了制备、提取纳他霉素的新工艺技术。其技术方案是：采用褐黄孢链霉菌，经孢子悬浮液的制备、种子培养、发酵、提取工序；通过控制pH值和溶解氧水平，及在发酵期间分批次流加葡萄糖的方式制备纳他霉素，提高其产量并采用低温蒸发去除甲醇法提取纳他霉素。本发明工艺简单、经济、实用、提高了纳他霉素的产量和纯度、降低了生产成本，促进其生产的工业化进程。为纳他霉素的广泛应用提供了先决条件。既有经济效益又有社会效益。

主权项

1.纳他霉素的制备方法，其特征是发酵法生产纳他霉素，采用褐黄 孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)，经孢子悬浮液的制备、种子培养、 发酵、提取工序；通过控制pH值和溶解氧水平，以及在发酵期间分批 次流加葡萄糖进行生产纳他霉素，并采用低温蒸发法去除甲醇提取纳他 霉素；具体步骤包括如下： (一)制备纳他霉素发酵液 ●孢子悬浮液的制备 生产菌种为褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)，其原始菌种 是从美国典型培养物收集中心处获得，其保藏号为ATCC13326，通过 DES和UV诱变，筛选高产菌株，将该生产菌株在琼脂斜面上生长4-8 天后，4℃保藏待用；其中，制作孢子悬浮液采用的液体为无菌水或新鲜 种子培养基，灭菌条件为：121℃，灭菌15～25min，孢子浓度选择为108 个/mL； ●种子培养 将上述制备好的孢子悬浮液加入到含碳源、氮源、无机离子和微量 元素组成的种子培养基中，灭菌条件为120～125℃，灭菌15～25min；在 摇床上200rpm转速下，28～30℃培养20～28h，在培养过程中不需要搅拌 和通气，即可得到适合接种的种子培养物； ●发酵生产纳他霉素 将长好的种子接入到经灭菌的含有大豆蛋白胨、酵母粉和葡萄糖的 发酵培养基中，按2％的体积比接种，在发酵过程中，需要流加消泡剂控 制泡沫，同时还需不断分批流加50％的葡萄糖溶液，并通过调节发酵罐 的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶解氧水平在10～30％，pH 5.5～6.0，发酵96～168h后即可得到含4.0～5.6g/L纳他霉素的发酵液； (二)从发酵液中提取纳他霉素 该步骤包括：浓缩发酵液；加入甲醇，升高pH；去除菌丝体；再降 低pH，蒸发甲醇；回收沉淀、进行干燥得到纳他霉素固体；其具体方法 是： ●浓缩发酵液 任选一种浓缩液体的方法均可，如蒸发、过滤、离心或离心过滤法； 采用蒸发法浓缩发酵液时，使发酵液浓缩到原体积的1/2以下； 采用过滤法浓缩发酵液时，其滤布孔径不应太大，尽量减少发酵液 中的悬浮物透过滤布； 采用重力离心处理时，检测离心上清液中纳他霉素的含量，选择一个 合适的转速使发酵液中的悬浮物离心下来； 采用离心过滤法处理时，可将离心和过滤结合起来，在离心的过程 中，同时完成过滤； ●加入甲醇、升高pH 向上述浓缩的发酵液中加入甲醇，并加碱调节pH到10～11，使浓缩 液中的纳他霉素完全溶解； ●去除菌丝体 采用重力离心、过滤或离心过滤法除去菌丝体； ●降低pH、蒸发除甲醇 加酸调节pH到6.5～7.5，使溶解的纳他霉素部分沉淀下来；为保持 纳他霉素的活性，采用低温蒸发去除甲醇，降低纳他霉素的溶解度，加 速纳他霉素的沉淀； ●固液分离和干燥。 将上述结晶的纳他霉素，任选一种固液分离的方法，如过滤或离心 得到沉淀，再经水多次洗涤，使获得的固体颜色成为白色或者通过以上 的方法再次对获得的纳他霉素进行重结晶，或用活性炭脱色处理，提高 纳他霉素的纯度，最后干燥，其方法如常温干燥、真空干燥、喷雾干燥 或真空冷冻干燥等，即得到纯度不小于80％的纳他霉素。