[发明专利]一种植物基因重组表达载体的构建方法

摘要

本发明一种植物基因重组表达载体的构建方法，属于三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因表达载体的构建。利用RT－PCR技术从盐生植物三角叶滨藜总RNA中，扩增并克隆了BADH基因。该基因全序列显示，核苷酸序列长1520bp，推测的氨基酸序列全长500个氨基酸残基。利用BamHI和SacI酶切位点将BADH基因连接到pCAMBIA2301的多克隆位点，并把35S启动子和nos终止子分别连接到BADH基因的上游和下游的多克隆位点上，获表达载体pCBAMATBADH682，正用于农杆菌介导转化油菜，希望通过转基因技术获得耐盐油菜新种质。

主权项

1、一种植物基因重组表达载体的构建方法，包括：1)三角叶滨藜RNA提取用Trizol法抽提三角叶滨藜总RNA；2)引物设计及目的基因的扩增根据本实验室克隆的三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因BADH cDNA拼接序列，设计下列引物，TBf： 5’-TTCA G↓GATCCATGGCGTTTCCTATGCC-3’ BamHITBr： 5’-TCA GAGCT↓CTAAGGAGACTTGTACCAG-3’ Sacl以三角叶滨藜总RNA为模板，参照TakaRa RNA PCR kit(AMV)ver21提供方法进行cDNA合成及PCR扩增；3)BADH基因克隆和DNA序列测定PCR产物经1.5％(g/100ml，下文同)琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA gelextraction Kit回收纯化，将回收的DNA片段插入pMD18-T载体，构建重组质粒pBADH，转化感受态大肠杆菌JM109，根据α互补原理，酶切电泳法以及PCR法筛选重组子pBADH，DNA测序，三角叶滨藜BADH基因核苷酸序列为SEQID NO.1和推测的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；4)植物重组表达质粒的构建用BamHI和SacI双酶切消化pBADH以及pCAMBIA2301，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA gel extraction Kit回收纯化BADH基因片段以及线性载体片段，并用T4DNA连接酶连接两片段，然后将35S启动子和nos终止子分别构建于重组载体的BADH区段上下游多克隆位点上，获植物重组表达质粒pCAMATBADH；5)转化植物重组表达质粒pCAMATBADH转化大肠杆菌JM109，将转化产物均匀涂布于在含100mg/L Kan的LB平板上，于37℃培养14个小时；挑取单菌落，分别接种于3mL含100mg/L Kan的LB液体培养基中，于37℃下，200rpm/min振荡培养过夜；用3S plasmid Miniprep Kit V3.1抽提质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳检验和PCR及酶切鉴定，确认外源片段已插入到pCAMBIA2301的多克隆位点上，其中35S和nos插入片段的PCR检测及酶切分析未显示，即获得植物基因重组表达载体。