[发明专利]甘油氧化酶制剂的制备方法及其在测定血清甘油三酯中的应用

摘要

甘油氧化酶(GO)制剂的制备方法及其在测定血清甘油三酯中的应用。制备方法由菌种选育与培养，亚硝基胍诱变，菌体收集，液氮研磨，硫酸铵分级沉淀，蛋白脱盐，凝胶过滤层析，离子交换层析，冷冻干燥等步骤完成。GO的应用方法包括试剂配制：即0.1mol/L TES缓冲液配制、储存液配制、三酶合剂配制；贮存液与三酶合剂按体积比14∶1比例配制成工作液，空白管、标准管、样品管各注入3.0ml工作液，并分别注入0.05ml蒸馏水、0.05ml甘油标准液、0.05ml待测样品液，37℃水浴保温20分钟，500nm波长比色，计算TG含量。本发明解决了GO的批量化生产问题，其应用代替了磷酸甘油氧化酶法(GPO法)中的GK和GPO两种酶，大大降低了原材料成本，其推广应用可产生明显的社会效益和经济效益。

主权项

1.一种甘油氧化酶制剂的制备方法，其特征为该方法是按照以下步骤实现的：——菌种选育与培养：取日本曲霉AS8586接孢子于土豆斜面培养基上，30℃培养4天；——亚硝基胍诱变：将培养的AS8586土豆斜面培养基用无菌水冲洗制备孢子悬液，并稀释至107/ml孢子；按重量体积比1∶1的比例，称取亚硝基胍于三角瓶中，接入上述孢子悬液并充分混匀后，摇床震荡100分钟时取出0.5ml菌液，用生理盐水稀释至102/ml孢子，取0.1ml涂布土豆斜面培养基上30℃温箱培养，长出单菌落时，随即挑取20个菌落划斜面，温箱培养24小时，将菌种斜面用无菌水冲洗制备孢子悬液按体积比1∶100的比例将孢子悬液接入盛有原始发酵液体培养基的三角瓶中，30℃摇床培养48小时；——菌体收集：以布氏漏斗真空抽滤菌体，蒸馏水充分洗涤去除残留的发酵液体培养基至滤液无色透明为止，抽干后的菌体称重；——液氮研磨：将102/ml的菌体放入研钵，按菌体1ml加1克石英沙和1ml液氮的比例，加入石英沙和液氮，充分研磨，重复6次，溶于100ml的0.05mol/L硼酸缓冲液中使pH为9.5，充分混匀，于8000rpm离心30分钟，收集上清液；——硫酸铵分级沉淀：将盛有上清液的烧杯放在另一装有冰水的大烧杯内，磁力搅拌，边搅拌边徐徐加入硫酸铵至40％饱和度，4℃静止1小时后20000g离心20分钟，收集上清液继续加入硫酸铵至80％饱和度，搅拌10分钟，4℃静止1小时后20000g离心20分钟，收集沉淀；——蛋白脱盐：将分离得到的沉淀物，溶于0.05mol/L的硼酸缓冲液中，装入透析带，在体积比为1∶100的同种缓冲液中透析除盐24小时，其中更换透析液3次；——凝胶过滤层析：将透析后样品上样于预先经0.05mol/L硼酸缓冲液充分平衡的1×100cm的Sephadex G-200柱进行层析分离，流速为0.2ml/min每管收集20min；洗脱液与平衡液相同，层析时监测A280紫外吸收和酶的活性，确定GO所在的蛋白峰，合并收集液；——离子交换层析：将上述合并收集的组分上样于DEAE-SephadexA-25柱，进行离子层析分离、收集紫外吸收部分酶活在5u/ml以上组分；——冷冻干燥：将上述得到的样品放入培养皿，-20℃冷冻过夜，第二天放入冷冻干燥机冻干10小时，即可制得甘油氧化酶制剂成品。