[发明专利]利用AFLP指纹技术鉴定家蚕和桑树品种的方法

摘要

本发明公开了一种利用AFLP指纹技术鉴定家蚕和桑树品种的方法。是在AFLP指纹技术的基础，以特定家蚕和桑树不同品种的基因池DNA为模板，以限制性内切酶EcoR I和Mse I酶解，然后酶切片段跟含有与其共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点来设计引物，并以特定引物对家蚕和桑树不同品种的预扩增、选择性扩增共二次扩增结果为依据，构建家蚕和桑树品种的标准DNA指纹图谱，将待测家蚕和桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。本发明为保护桑树育种产权、登录新品种、鉴定和检测苗木真实性和纯度、仲裁苗木纠纷和规范苗木市场提供技术保障。

主权项

1、利用AFLP指纹技术鉴定家蚕和桑树品种的方法，其特征在于其步骤如下：(1)基因池DNA的来源从同一品种不同个体的家蚕或不同植株的桑树的任何组织器官提取DNA，混合成品种的基因池；(2)AFLP接头和二次扩增即预扩增、选择性扩增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下：EcoRI接头5′-CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为：5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为：引物编号 引物序列 1 GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAA 2 GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACTT 3 GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAC 4 GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAG 5 GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAT 6 GACTGCGTACCAATTCACC/GATGAGTCCTGAGTAACAA 7 GACTGCGTACCAATTCACC/GATGAGTCCTGAGTAACTT 8 GACTGCGTACCAATTCACC/GATGAGTCCTGAGTAACAC 9 GACTGCGTACCAATTCACC/GATGAGTCCTGAGTAACAG 10 GACTGCGTACCAATTCACC/GATGAGTCCTGAGTAACAT 11 GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA 12 GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACTT 13 GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAC 14 GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAG 15 GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAT 16 GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACAA 17 GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACTT 18 GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACAC 19 GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACAG 20 GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACAT(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切每个反应总体积为25μl，其中包括：DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，20～50℃保温20min～8h；B.DNA片段接头的连接酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液：EcoRI adaptor 5 pmol，MseI adaptor 50pmol，T4 DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4 DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/LDTT，0.1mmol/L ATP)，10～40℃连接1～16h；C.DNA片段的预扩增取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液：EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增：94℃ 20～60sec，56℃ 0.5～2min，72℃ 0.5～2min，20～40个循环，预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液：EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增：94℃ 20～60sec，65℃(每循环降低0.7℃)20～60sec，72℃ 0.5～2min，10～20个循环后变为：94℃ 20～60sec，56℃ 20～60sec，72℃ 0.5～2min，20～30个循环，反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，置于冰上冷却，待用；E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)20～50min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(50～100w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇10～30min或直到指示剂颜色消失为止；b.用双蒸水漂洗凝胶3次，每次1～5min；c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgN03，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇20～40min；d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30gNaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中；从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过5～15sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次1～5min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建以上述特定引物对家蚕和桑树不同品种进行预扩增和选择性扩增，以二次扩增结果为依据，构建家蚕和桑树品种的标准DNA指纹图谱；(5)家蚕和桑树品种的鉴定将待测家蚕和桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。