[发明专利]利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法

摘要

本发明公开了一种利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法。利用细菌转座子作用原理，在大肠杆菌内即能完成家蚕重组杆状病毒的构建。利用家蚕杆状病毒BmNPV和AcNPV基因组高度同源，借鉴AcNPV Bac－to－Bac表达系统的构建方法，利用基因重组原理，构建适用于可利用我国特色资源—家蚕的新型快速表达系统。解决了在重组病毒构建过程中传统的需要利用昆虫培养细胞进行重组病毒的空斑筛选的过程中费时费力的缺点，缩短了重组病毒构建所需时间，加快了基因表达系统的工作进程。在未来生物技术产业利用家蚕作为“生物工厂”表达生产重组蛋白、基因药物、工程疫苗及后基因组时代蛋白质结构功能分析方面，具有推广的使用价值。

主权项

1、一种利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法，其特征在于：(1)家蚕野生型BmNPV基因组中多角体启动子左右侧翼各约2kb基因序列的克隆，设计的引物为：左侧正向引物5-GTTCTTTGCTGTTCACGCCAATTC-3；反向引物5-ACACGAAAAGT ACAAACACGATAGC-3；右侧正向引物为5-CAGCTTGCTGATCACGCAATTG-3；反向引物为5-GTTCGATAACTACCGACACGTCGAC-3；左侧2kb基因PCR反应的条件为：反应液含2.0ul的0.1ug的家蚕BmNPV基因组DNA作为模板，4.0ul的2.5mM的dNTP，2.0ul的20pmol的左侧基因正反向引物，1单位的Taq DNA聚合酶，及5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH8.3 PCR缓冲液，并加入超纯水至50ul，反应进行30个循环反应条件为95℃变性60秒，57℃退火30秒，72℃延伸5分，最后一个循环的延伸时间为10分，右侧2kb基因PCR反应的条件与左侧2kb基因PCR反应条件相同，但引物采用右侧2kb基因的正反向引物，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析；(2)含有单拷贝数F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点AttTn7、编码LacZα肽的部分DNA片段和卡那霉素抗性选择标记基因的8.6kb片段的克隆，引物设计如下：正向引物5-GGAATTCCCCAATCGATGTC-3，含EcoRI位点，反向引物5-TTTCTAGACCACCGCTTACG-3，含XbaI位点；PCR反应的条件为：反应液含1.0ul的0.1ug的购自美国Invitrogen公司AcNPV Bac-to-Bac表达系统病毒穿梭载体Bacmid基因组DNA作为模板，2.0ul的2.5mM的dNTP，各1.0ul的20pmol的正反向引物，0.5单位的Taq DNA聚合酶，及2.5ul含50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl，pH8.3 PCR缓冲液，并加入超纯水至25ul，反应进行30个循环，反应条件为95℃变性50秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分，最后一个循环的延伸时间为10分；(3)将上述获得的BmNPV基因组中多角体启动子左右侧翼各约2kb片段分别进行末端处理加上EcoRI位点和XbaI位点，并对克隆得到的8.6kb的片段进行EcoRI和XbaI消化处理，分别取2ul并加上连接酶进行体外14℃温度下连接，使之成为一个大小为12.6kb的线性片段；(4)从AcNPV Bac-to-Bac表达系统DH10Bac感受态细胞中分离出13.2kb辅助质粒helper plasmid，采用常用的DNA分离方法，收集过夜培养的转化菌，先后加入0.2N的NaOH-SDS，醋酸钾KAc和苯酚，最后用异苯醇沉淀DNA，融解于TE缓冲液；(5)将(3)连接得到的线性片段与家蚕130kb BmNPV基因组混合，在离子脂质体Lipofectin介导下共转染入家蚕培养细胞，从感染的细胞中分离出病毒基因组，即BmNPV和重组的BmNPV基因组的混合物；在脂质体介导下共转染入BmN单层培养细胞，培养基不含血清，24小时后更换含10％胎牛血清的培养基，27℃培养5天，收集感染细胞并从中抽提病毒基因组DNA，将其转化入大肠杆菌DH10β感受态细胞，在含有卡那霉素、X-gal培养基上利用蓝白斑分析法筛选出含病毒穿梭载体的转化子，即蓝斑，并将其命名为家蚕病毒穿梭载体BmBacmid，野生型BmNPV基因组的转化子因不含有卡那霉素抗性基因不能在培养基上生长，最后分离得到蓝斑的家蚕BmBacmid转化子；(6)将转化子进行象普通大肠杆菌细胞培养的方法，制备其感受态细胞，并将13.2kb辅助质粒转化入其中，在含有四环素和卡那霉素的培养基上进行筛选，获得同时含家蚕病毒穿梭载体BmBacmid和辅助质粒的转化子，将其命名为DH10BmBac，这样就构建完成了适合于家蚕的重组病毒快速基因表达系统，可以用于重组蛋白质的生产。