[发明专利]磁性聚乙烯醇载体固定化德氏假单胞菌R－8进行油品脱硫的方法

摘要

本发明涉及磁性聚乙烯醇复合载体固定化德氏假单胞菌R－8进行油品脱硫的方法，将德氏假单胞菌R－8的细胞悬液、亲水性磁流体、聚乙烯醇水溶液混合均匀，通过重复的冷冻－解冻程序制得磁性聚乙烯醇固定化细胞颗粒；然后增殖培养该固定化细胞用于油品脱硫；该磁性固定化细胞可以多次重复使用。上述方法的固定化细胞活性高、稳定性好、易于回收生物催化剂重复使用，并可避免游离细胞脱硫反应所产生色素对油品的污染；聚乙烯醇价格便宜，生物相容性好；在外加磁场作用下，磁性载体分离迅速、方便。制备工艺简单，回收简单快速，生产成本低，并易于在工业上应用。

主权项

1.一种利用磁性聚乙烯醇固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法，其特征如下：1)保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8对数生长期或静止期细胞的制备挑取1～2环斜面保存或0.5-1毫升甘油保存的德氏假单胞菌R-8菌株，加入到体积为20-50毫升的培养基中，在30℃，170r/min的条件下培养1～2天后，再将培养后的德氏假单胞菌R-8菌株接种至含150ml上述培养基的500ml三角瓶中，摇床或发酵罐培养，5000rpm离心6min获得德氏假单胞菌R-8对数生长期或静止期细胞；将收集到的细胞用生理盐水洗涤2～3次，所得菌体悬浮于生理盐水中，得保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液；在4℃冰箱中放置待用；所用培养基组成如下：去离子水1000ml，KH2PO4 2.44g；Na2HPO4·12H2O 12.03g；NH4Cl 2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g，硫源为二苯并噻吩，硫酸钠或二甲基亚砜；2)亲水性磁流体的制备在盛有500ml蒸馏水的1升搅拌式反应器中按2∶1的比例加入0.086mol氯化亚铁(FeCl2·4H2O)和0.173mol三氯化铁(FeCl3.6H2O)，在N2保护下升温至90℃，倾入含0.956mol NH3·H2O水溶液，并滴加油酸约15ml，继续恒温30min，用磁铁分离后，经去离子水反复清洗，得到黑色团块状磁性Fe3O4凝胶体，加入去离子水，在搅拌下升温至50℃，加入25％的NH3·H2O数滴，凝胶溶解形成亲水性磁性Fe3O4流体3)用磁性聚乙烯醇复合载体包埋保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8菌体称取聚乙烯醇溶于去离子水、生理盐水或增殖培养基中，制成质量百分比浓度为8～20％的聚乙烯醇水溶液，加入一定体积的磁流体使其质量百分浓度为1～10％，然后与含德氏假单胞菌R-8菌体的生理盐水菌悬液均匀混合；将此混合液用针筒、滴定管或其它装置挤入到装有液氮的保温瓶或保温杯中，形成直径为1-5mm用磁性聚乙烯醇载体固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8细胞的小球；保温杯密封24-96h；然后，将保温杯敞开，自然解冻；解冻完成后，再次加入液氮密封24-96h；这个冷冻-解冻过程重复1-5次；用去离子水或生理盐水洗涤2-4次4)增殖培养上述固定化细胞将第3步中所制得的磁性聚乙烯醇复合载体固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的固定化细胞悬浮于固定化细胞增殖培养基中，硫源为二苯并噻吩；于30℃，170r/min条件下摇床培养1～3天；所用增殖培养基组成如下：去离子水1000ml，KH2PO4 0.24g；Na2HPO4·12H2O 1.20g；NH4Cl2.0g；MgCl2·6H2O 0.4g；CaCl2·2H2O 0.001g；FeCl3·6H2O 0.001g；MnCl2·4H2O 0.004g；甘油10g5)油品脱硫；取增殖培养活化后的磁性聚乙烯醇复合载体固定化的保藏号为CGMCC 0570的德氏假单胞菌R-8的固定化细胞，倾去培养液，加入含硫油相和水相，进行脱硫反应，水相的体积占油水相总体积的0～50％；当硫含量降到0-30ppm以后，在外加磁场的作用下，磁性PVA固定化的细胞分离；油水相采用常用的液液分离手段分离；所述水相为生理盐水、PH＝6.0-7.0的磷酸缓冲溶液或增殖培养基。