[发明专利]一种牛肾上腺髓质嗜铬细胞分离纯化的方法

摘要

一种牛肾上腺髓质嗜铬细胞分离纯化的方法，逆肾上腺静脉灌注胶原酶溶液，在一定温度下，充分水解肾上腺髓质细胞与皮质细胞、髓质细胞之间的胶原蛋白成分。剥离后的髓质通过机械剪切和梯度过筛，得到离散的肾上腺嗜铬细胞悬液，再利用悬液中细胞密度的差异将细胞进行纯化。利用Percoll非连续密度梯度法纯化牛肾上腺嗜铬细胞，平均每个肾上腺可分离得到0.7×10⁸～3.1×10⁸个纯度在95％以上的嗜铬细胞，而且细胞形态良好、活性达到99％。

主权项

1.一种牛肾上腺髓质嗜铬细胞分离纯化的方法，其主要步骤是：分离：a)选择牛肾上腺，保存于0-6℃的D-Hank’s液中；b)逆静脉灌注无钙、镁D-Hank’s液后，将肾上腺浸泡在D-Hank’s液中，使残留在血管中的血细胞充分渗出；c)逆肾上腺静脉灌注质量百分比浓度为0.05-0.15％的I型胶原酶2-7ml，在37℃恒温震荡水浴中消化20-50min，使皮质和髓质及髓质细胞之间的胶原成分充分解离；d)剥除皮质，将髓质剪碎成0.5-1.5mm3左右的小块，滴加D-Hank’s液以保持髓质的营养；e)将剪切后的髓质块依次研磨过50、200、350目筛网，并用D-Hank’s液冲洗过滤；收集的细胞用D-Hank’s液离心洗涤，最终接种于含有体积比5-20％牛血清的DMEM培养液中；纯化：f)分别配制密度为1.090g/ml、1.064g/ml、1.034g/ml和1.019g/ml的Percoll溶液；g)将分离步骤中e制得的细胞悬液沉淀，与密度为1.090g/ml的Percoll溶液混悬后，加入离心管底，在其上依次加入密度为1.064g/ml、1.034g/ml、1.019g/ml的Percoll溶液离心；h)收集介于密度为1.064g/ml与1.034g/ml的Percoll溶液之间的细胞，加入D-Hank’s液离心洗涤；最终将细胞接种于含有体积比5-20％牛血清的DMEM培养液中培养。