[发明专利]运用龙血树组织培养生产血竭的方法

摘要

本发明公开了一种运用龙血树组织培养生产血竭的方法，它是以龙血树的幼枝顶端生长点作为外植体，在诱导愈伤组织的培养基上培养诱导产生愈伤组织，愈伤组织再诱导分化形成丛生芽，丛生芽经过继代增殖并在增殖培养基中加入诱导血竭产生的植物生长素，以产生血竭并分泌到培养基中，培养基则直接用于分离和提取血竭。本发明所提供的龙血树组织培养生产血竭的技术，很好地解决了因龙血树资源匮乏而不能生产大量血竭的问题，为利用生物工程技术生产血竭提供了技术保证，该技术将对龙血树资源的保护、开发和利用提供有效的新途径，具有重要的经济、社会和生态效益。

主权项

1、一种利用龙血树组织培养生产血竭的方法，包括愈伤组织的诱导过程、丛生芽的诱导过程、继代增殖培养及血竭的产生过程和血竭的提取过程，其特征在于：(1)所说的愈伤组织的诱导过程是取生长健壮的龙血树的幼枝顶芽，剥除其叶片，再用水冲洗干净，然后在无菌条件下先用70-80％的乙醇溶液进行表面消毒，再把小芽投入0.05-0.2％氯化汞水溶液中进行消毒处理，期间不断地进行摇动，使小芽始终浸泡在氯化汞水溶液中，8-15分钟后取出小芽用无菌水冲洗2-3次，再用无菌滤纸吸干水分；然后剥取其生长点并接种到预备好的愈伤组织诱导培养基上，先进行避光培养，再转入自然光下培养，以诱导愈伤组织的产生；所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D 0.5-2.2mg.L-1，蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1；(2)所说的丛生芽的诱导过程将上述获得的愈伤组织切成小方块，接种于芽诱导培养基上进行培养，以诱导芽的分化；所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，然后按比例添加有6BA1.0-5.0mg.L-1、NAA0.1-0.3mg.L-1、蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1；(3)所说的继代增殖培养及血竭的产生过程是把在诱导培养阶段所形成的芽切割后接种于增殖培养基上，并在光照条件下培养，以诱导形成丛生芽，接着将形成的丛生芽再分割成小芽块接种于已加入植物生长素的培养基上进行继代增殖并在1000-2000Lx的光照条件下培养，便可在芽的切割部位产生血竭并分泌到培养基中而使培养基开始变成淡红色，随着培养时间的增加，产生的血竭也不断地增加并分泌到培养基中，同时血竭的有效成分的种类和数量也随之增加使整个培养基呈现出深红色，此时丛生芽可继续用于下一周期的继代增殖，而呈深红色的培养基可直接用于提取血竭；所述增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，然后按比例添加有6BA1.8-6.0mg.L-1、KT0.3-0.6mg.L-1、蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1；(4)所说的血竭的提取过程是将含有血竭的培养基烘干，然后用分析纯甲醇溶解已烘干的培养物，之后再经过滤并弃其残渣，所得滤液再用石油醚萃取，静置后分层；待甲醇层回收溶剂至小体积后再加入蒸馏水，使甲醇浓度达到28-35％，接着再进行过滤得到滤液和滤渣；将滤液于Diaion树脂上层析，再用蒸馏水洗脱除去寡糖，然后又用甲醇洗脱，回收甲醇洗脱液后用SephadexLH-20层析，再以45-55％甲醇为洗脱剂进行洗脱，得到若干个流分；所得流分用MCIgel柱或SephadexLH-20层析纯化，得若干化合物；将滤渣先以石油醚-丙酮的混合溶液为洗脱剂用200～300目硅胶柱层析，获得若干流分段，再经SephadexLH-20柱层析，再用MCIgel柱分别纯化，获得若干化合物；以上所得化合物即为血竭的有效成分；所述石油醚-丙酮混合溶液中石油醚与丙酮的体积比为5∶3。