[发明专利]一种利用全细胞PCR检测蓝藻藻种的方法

摘要

本发明公开了一种利用全细胞PCR检测蓝藻藻种的方法，该方法包括下列步骤：1.全细胞扩增前处理；2.设计引物进行PCR反应；3.PCR反应条件的确定；4.PCR产物克隆测序；5.序列结果分析。本发明方法有效、简单、易行，利用rDNA通用引物扩增，表明在反应体系中加入蓝藻细胞能扩增出目的条带；对已知的蓝藻藻种PC基因的分析设计引物，全细胞PCR可扩增出蓝藻藻种的部分PC序列以及PC－IGS序列，序列分析结果表明PC－IGS序列能用来作为检测蓝藻藻种的分类依据，所得结果和以rDNA扩增全细胞测序后分析的结果一致。

主权项

1.一种利用全细胞PCR检测蓝藻藻种的方法，包括下列步骤：A.全细胞扩增前处理：离心沉淀0.5-2mL蓝藻藻液，无菌蒸馏水洗涤3-5次后，用1-2mL的蒸馏水定容，超声波处理5-15min，使丝状体或群体分成单个细胞，显微镜下血球记数板记数，取20-1000个蓝藻细胞作为模板进行PCR扩增；B.设计引物：根据Genebank中登录的蓝藻藻种pcb和pca基因设计引物，进行扩增，鱼腥藻PC基因的PC-IGS序列为：上游引物：5’-GCTTAAATGGCTTACGKGAAAC-3’下游引物：5’-AAACCACGAGCAGCTTCC-3’；C.PCR的反应条件为：94℃预变性5min，94℃ 30sec，52℃-56℃30sec，72℃1min循环30次，72℃延伸7min，反应总体积为50μL，其中MgCl21.5mmol/L，引物1μmol/L，10X缓冲液5.0μL，dNTPs 0.2mmol/L以及1U的Taq酶，10％BSAw/v，1.0μL-5.0μL，DNA模板约50ng；D.PCR产物克隆测序：PCR产物用0.8-1％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，紫外灯下用解剖刀切割下目的条带，保生物凝胶试剂盒回收目的条带后和T载体连接，连接产物转化用MgCl2制备的感受态大肠杆菌DH5α，菌斑PCR筛选阳性克隆；E.序列结果分析：测序结果采用Clustal软件进行多序列比对，利用Blast在线查找最相近的序列。