[发明专利]一种分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法

摘要

一种分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法，涉及PCR－DGGE技术对城市污水厂污泥微生物群落构成的分析方法。包括第一步DNA提取；第二步PCR扩增；第三步PCR产物浓缩；第四步DGGE电泳分离得DGGE图谱。其特点是：第一步DNA提取分两次直接得到总DNA。先取2～5g污泥样品，用DNA提取液等对污泥进行DNA提取后，沉淀中再加入DNA提取液等离心收集上清液，合并上次上清，再在上清液中加入由氯仿和异戊醇组成的混合液，离心，取上层水层，重复上步操作离心，合并水层，完成DNA提取。第四步，DGGE使用变性梯度为30％～60％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后得反映城市污水厂污泥微生物群落构成的DGGE图谱。本发明省时省力、简捷准确、成本低。可广泛应用于各类城市污水厂污泥微生物群落构成的分析。

主权项

1.一种分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法，包括第一步DNA提取；第二步PCR扩增：在提取的DNA中加入引物和反应体系，PCR扩增程序为：起始94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃引物复性45s，72℃引物延伸90s，30个循环；72℃终延伸20min，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物，电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液；第三步PCR产物浓缩：合并数管PCR扩增后产物，用Parafilm膜封口，置于-70℃冰箱冷冻过夜保存，取出后用冷冻抽干机浓缩处理4小时，将得到的干粉溶解于30μl pH为7.6的TE缓冲液中；第四步DGGE电泳分离得DGGE图谱，其特征在于：第一步DNA提取是分两次直接提取污泥的总DNA的，首先称取2～5g污泥样品，用13.5-27ml的DNA提取液、40-60μL20mg/mL溶菌酶和1.5mL20％SDS，65℃度水浴2小时，每隔15-20分钟轻摇几下，离心收集上清液置于离心管中，沉淀中再加入4.5mL DNA提取液和0.5mL 20％的SDS，离心收集上清液合并于上次上清，在上清液中加入等体积的由氯仿和异戊醇按24∶1体积比组成的混合液，离心10min，取上层水层于另一离心管中；在沉淀中重复上步操作：加入氯仿异戊醇混合液后离心，合并水层，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置1h，9000r/min离心20min，收集沉淀溶解于500μL pH为7.6的TE缓冲液中；第四步，DGGE电泳分离：首先制备变性梯度为30％～60％的聚丙烯酰胺凝胶，然后使用电泳缓冲液为1×TAE，电压150V，60℃，电泳4～8h，溴乙锭染色20～40min，得DGGE图谱。