[发明专利]用能产生人IgGl重链－κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用

摘要

生物工程领域中，用能产生人IgG1重链－κ轻链的小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用。特征：在小鼠轻链κ恒定区和重链g1恒定区基因位点上分别敲入人κ链和g1恒定区基因；用该小鼠制备的人源化单克隆抗体是抗体的恒定区与人抗体完全相同，而可变区为鼠源，制备步骤：小鼠κ链和g1链基因组的获得；敲入载体的构建；在ES细胞中进行同源重组；轻、重链转化小鼠的产生；轻、重链小鼠进一步交配，得到完整嵌合基因的小鼠；应用：取抗原免疫嵌合小鼠的脾脏与骨髓细胞进行融合、培养；筛选产生抗原特异性的人源化单克隆抗体的杂交瘤；制备抗原特异性的人源化单克隆抗体。优点：技术操作简便；重组正确率高；不影响抗体表达时可变区的基因重排模式，易获得高亲和力的人－鼠嵌合抗体。

主权项

1、用能产生人IgG1重链-κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体，包括：基因克隆、载体构建、转化细胞、转化小鼠、表达筛选、小鼠免疫、细胞融合、抗体制备，其特征在于：a)所采用的小鼠是在小鼠的Ig轻链κ恒定区基因和Ig重链g1恒定区基因位点上，分别敲入人的Igκ恒定区和IgG1恒定区基因，而培育产生人IgG1重链-κ轻链的小鼠；b)所制备的人源化单克隆抗体是，其抗体的恒定区与人抗体完全相同，而与抗原结合的可变区则是与小鼠抗体相同的人-鼠嵌合抗体；c)筛选表达具有人IgG1重链-κ轻链的嵌合抗体鼠；d)通过抗原免疫、细胞融合获得可分泌人源化嵌合型单克隆抗体的杂交瘤细胞系；e)嵌合抗体的制备步骤是：第一步，从129sv小鼠的基因组DNA文库中克隆小鼠的Igκ链和IgG1链基因组基因；第二步，基因敲入载体的构建轻链载体——将完整的人Igκ基因片段插入小鼠的Igκ基因位点，使得小鼠κ基因5’端的一小段编码区被缺失，以在插入人κ基因的同时保证灭活小鼠κ基因，人κ基因下游插入正筛选基因neo(neomycinphosphotransferase)表达单位，在3’同源区下游插入负筛选基因白喉毒素A单位(DTA)表达单位，5’和3’同源区的大小分别为6kb和8kb；重链载体——在人分泌型IgG1基因的下游插入小鼠IgM的膜外显子，再在下游插入正筛选基因表达单位，将构建的这一片段插入小鼠的IgM基因编码区靠近5’端处，使得插入这一基因片段的同时完全灭活小鼠的IgM基因，同源区下游插入负筛选标志，5’和3’同源区的大小分别为5kb和7bk；第三步，在ES细胞中进行同源重组培养小鼠ES细胞系E14，用电穿孔法分别将构建的基因敲入载体转染入ES细胞中，在G418存在下进行培养和筛选；第四步，嵌合小鼠的产生交配C57BL/6小鼠，在交配后4.5天时从妊娠的小鼠子宫收集囊胚，将同源重组的ES细胞通过显微注射，注射入C57BL/6小鼠的囊胚腔中，再将囊胚移植到假孕的ICR小鼠的子宫中，出生的小鼠根据眼的颜色和毛色判断嵌合程度；第五步，将轻链小鼠与重链小鼠进一步交配，得到轻链和重链基因位点上都是敲入的基因的小鼠；第六步，人源化单克隆抗体的制备。