[发明专利]四倍体刺槐转基因及组培快繁方法

摘要

本发明公开一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，由以下步骤组成：将四倍体刺槐当年生新梢的茎段，消毒后经启动培养基、诱导培养基培养，得到的愈伤组织，经含有双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌系转基因处理后，再经分化培养和选择培养获得的Kan抗性植株，经分子检测筛选出转化植株，转入生根培养基，经过驯化炼苗后，栽入大田。本发明的方法为农杆菌介导的目的基因在木本植物上的转化及包括丛生芽分化、生根和移栽等组培快繁技术提供了依据。

主权项

1、一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，由以下步骤组成：(1)将四倍体刺槐当年生新梢的茎段，消毒后接种在启动培养基中，15～30天后转接到愈伤组织诱导培养基中，得到的愈伤组织，经如下含有双元载体pBin438的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌系转基因处理后，再接种到分化培养基中形成丛生芽；上述启动培养基的组成为：MS培养基、6-BA 0.2～1.5mg·L-1、NAA 0.08～2mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、琼脂6～8g·L-1，pH值5.8；上述诱导培养基的组成为：MS培养基、KT 1.0～5mg·L-1、NAA 0.5～2mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、琼脂6～8g·L-1，pH值5.8；上述分化培养基的组成为：MS培养基、IBA 0.2～1.5mg·L-1、6-BA 2.0～4mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、琼脂6～8g·L-1，pH值为5.8；上述培养条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度40umol.m-2.s-1，光照时间14h·d-1；(2)挑选上述根癌农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，25-34℃，160-220rin/m条件下，培养18～26小时，转接于无抗菌素的YEB培养基中培养，菌液在离心后，再加入适量无菌MS液体培养基稀释至OD600 0.3～0.7；上述YEB培养基的组成为：每升含细菌蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉浸膏5g，MgSO4.7H2O 0.493g，pH7.0；(3)将上述愈伤组织切成小块或薄片，预培养1～5天后，侵染农杆菌菌液4～20min；向共培养培养基即分化培养基中加入15～40mg·L-1的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)，培养3～8天后转入分化培养基；10～50天后转入选择培养基选择培养80～120天，继代3～4次得Kan抗性植株；上述从转入分化培养基开始，加入浓度为400～600mg·L-1的头孢霉素(cefotaxime，Cef)抑制农杆菌；上述选择培养基的组成为：分化培养基、卡那霉素(kanamycin，Kan)50～100mg·L-1；(4)将上述获得的Kan抗性植株，经分子检测获得转化植株，如转化植株的丛生芽小苗健壮，可直接生根，如小苗细弱，可转入拔高培养基，经壮苗后转入生根培养基；上述拔高培养基的组成为：MS培养基、KT 1.0～4.0mg·L-1、6-BA 0.1～2.0mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、琼脂6～8g·L-1，pH值5.8～6.0；上述生根培养基的组成为：MS培养基、IBA 1.0～3.0mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、琼脂6～8g·L-1，pH值5.8～6.0；(5)幼苗在生根培养基中生长30天以后，90％以上都会发育成健壮的生根幼苗，经过驯化炼苗后，栽入大田。