[发明专利]家蚕作为“生物工厂”生产重组人VEGF的方法

摘要

本发明公开了一种家蚕作为“生物工厂”生产重组人血管内皮细胞生长因子VEGF的方法。利用构建的AcNPV和BmNPV的杂交杆状病毒HyNPV作为载体，构建了重组含有人VEGF基因的重组病毒。利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主，高水平表达了具有很高生物活性的重组人VEGF。解决了VEGF在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点，家蚕幼虫表达的重组人VEGF大部分被分泌进血淋巴中，非常有利于蛋白质的快速提取。实验结果证明利用重组杆状病毒以家蚕作为“生物工厂”生产重组人VEGF安全、实用、可行。重组VEGF可以大量生产为VEGF在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。

主权项

1、一种家蚕作为“生物工厂”生产重组人VEGF的方法，其特征在于：(1)VEGF基因的克隆：以人肺部组织抽提的总RNA为模板，利用Roche的Titan One Tube RT-PCR系统一步扩增得到人VEGF基因；引物设计如下：正向引物：5’-AGGGATCCCCCATGGCAGAAGGAG-3’，含有BamHI酶切位点，反向引物：5’-GAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3’，含有HindIII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：一个循环，94℃模板变性2分钟；10个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；25个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟，每个循环后次循环增加延伸时间5秒；最后1个循环，68℃延伸7分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆VEGF基因顺序正确性；(2)含有人VEGF基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-VEGF得到VEGF基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHis获得重组体pBlueBacHis-VEGF；通过共转染在昆虫细胞内与杂交杆状病毒HyNPV DNA同源重组产生重组病毒。然后在聚苯乙烯锥形管中加入1μgpBlueBacHis-VEGF DNA和15μg HyNPV DNA，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl；将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf 21培养细胞；用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒。重组病毒通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的病毒溶液，浓度为108pfu/ml。申请人将此重组病毒命名为HyNPV-VEGF；(3)家蚕体内表达和重组VEGF纯化：使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫。将幼虫的血淋巴作为重组人VEGF纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴：在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边。用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3PO4 50mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白；(4)重组VEGF活性分析鉴定：用人脐静脉内皮细胞HUVEC分析重组人VEGF的生物活性；细胞在含有Earle’s盐的培养基199中37℃培养，补充5％的CO2，培养基中另外添加100units/ml青霉素，100units/ml链霉素，4.0mg/ml两性霉素B，20％热灭活补加牛血清，5units/ml肝素和50mg/ml内皮细胞生长补充物质ECGS；细胞用胰蛋白酶消化后接种于24孔组织培养板，细胞密度大约为1.0×104cells/well，每孔加1ml同样的培养基。24小时后，将培养基更换为含有10％SCS和5units/ml肝素，但是不含有ECGS的新鲜培养基199；纯化的重组VEGF经梯度稀释后用0.22μm灭菌过滤器过滤灭菌，加入到培养板孔中，每孔体积不超过10μl；72小时后，用PBS洗两次，用胰蛋白酶消化后离心收集细胞，重悬于200μl PBS中，0.4％台酚蓝染色后，用血球计计算细胞个数；结果表明，重组VEGF能够刺激HUVEC增殖，这表明家蚕幼虫中表达的VEGF具有生物学活性。