[发明专利]一种制备人载脂蛋白A－Ⅰ的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备人载脂蛋白A－I(ApoA－I)的方法。具体涉及利用毕赤酵母系统，通过构建重组工程菌株、表达、分离纯化获得高效生产人载脂蛋白A－I的方法。本发明通过基因工程手段将来源于天然的apoA－I基因重组至P.pastoris宿主菌，表达水平可高达200mg/L，表达产物经冷丙酮分级沉淀和－Sepharose分离纯化获得电泳纯的ApoA－I蛋白。经Western－blot鉴定、蛋白质谱检测、N端氨基酸测序、细胞结合活性测定均与人血来源的ApoA－I蛋白一致。

主权项

1，一种制备人载脂蛋白A-I的方法，其特征是将apoA-I基因装入P.pastoris的分泌型表达载体上，线性化后转化P.pastoris甲醇酵母宿主菌，利用重组菌进行高效表达，用冷丙酮分级沉淀后经Q-Sepharose柱进一步分离，得到电泳纯的ApoA-I蛋白，包括下述步骤：1)构建重组质粒以昆虫表达系统的表达质粒DNA为模板通过PCR扩增获天然apoA-I基因片段，在apoA-I基因编码序列的5’端和3’端分别引入酶切位点Xhol I和EcoR I，双酶切后装入P.pastoris的分泌性表达载体上，获得重组表达质粒；2)构建ApoA-I表达菌株步骤1)的重组质粒用BglII线性化，电转化宿主细胞，转化液涂于MD平板，28-30℃培养至转化子长出；3)筛选高表达菌株步骤2)的转化子经G418抗性筛选，获得抗4mg/ml G418的高抗性菌株，经甲醇诱导获得高表达菌株；4)发酵、培养、分离ApoA-I蛋白步骤3)的高表达菌株发酵在优化后的BMGY内生长，诱导ApoA-I产生，上清液经丙酮分级沉淀、Q-Sepharose分离纯化，获纯的ApoA-I蛋白。