[发明专利]一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，在皮肤组织块培养过程中采用自行设计的培养基能有效抑制成纤维细胞的生长，从组织块四周生长出均一的上皮样细胞，诱发表皮干细胞迁移出原来的微环境，在新生成的上皮样细胞层上重新聚集生长。这类克隆性生长的细胞与其依赖的滋养层细胞有明显形态学上的差别。借助解剖镜和玻璃针就能将其挑选出来，进行单独扩增培养。对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：CK19，integrin－β即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。本发明克服了传统酶消化法的缺点，直接利用干细胞的生物学行为获得纯化的表皮干细胞，可用于人类和哺乳动物表皮干细胞的分离纯化。

主权项

1.一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)首先取一块皮肤，置于含青链霉素的生理盐水中，用含青链霉素的PBS(一)冲洗，去血污及毛发；2)在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小块，按表皮面朝上贴于玻璃平皿中，每皿3-4块，加培养基；培养基的配方为：Medium199+15～20％NBS即新生牛血清+5～8μg/mlinsulin(胰岛素)+0.5μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml；3)置于CO2培养箱中培养，培养箱内的条件为5％CO2，饱和湿度，37℃，每两天换液一次；4)经3天-4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7天-12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达100-150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin即胰蛋白酶和0.02％EDTA适当处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养；无血清培养基的配方为：F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/mlinsulin+20ng/mlIGF-1+0.4～0.6ug/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml。5)待细胞增殖达75％融合时，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，用无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存，将人类表皮干细胞传5代冻存；6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：CK19，integrin-β1P63，integrin-α6均为阳性，即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。