[发明专利]反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法

摘要

本发明涉及的反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，特别涉及一种新的直接从母液中为直接从固态或液态发酵制得的纳豆激酶粗提液中萃取纯化纳豆激酶，包括萃取步骤和反萃取步骤；所述的萃取步骤为纳豆激酶粗提液作为水相与反胶团溶液按比例混合，在10－35℃下进入萃取，使纳豆激酶进入反胶团溶液；再在反萃液中进行反萃取，在20－45℃温度下离心，分离得到纯化后的纳豆激酶水溶液。可解决目前纳豆激酶纯化工艺复杂、步骤多、周期长的问题；酶活回收率达到80％以上，纯化因子达到3以上；并且同时具有浓缩和脱色作用；采用反胶团技术分离纯化纳豆激酶周期短，便于连续操作，易于放大。

主权项

1、一种反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，为直接从固态或液态发酵制得的纳豆激酶粗提液中萃取纯化纳豆激酶，包括萃取步骤和反萃取步骤；1)所述的萃取步骤为：1.1)配制反胶团溶液：所述反胶团溶液的组分包括表面活性剂、助溶剂、有机溶剂和水，其重量份配比为表面活性剂∶助溶剂∶有机溶剂∶水＝20-100∶0-200∶800-912∶0-2；所述表面活性剂为阳离子型、阴离子型和非离子型表面活性剂中的一种或两种；所述助溶剂为丁醇、戊醇、己醇或庚醇；所述有机溶剂为戊烷、正己烷、环己烷、辛烷、异辛烷、庚烷和石油醚中的一种或两种或多种；其配制步骤为：按上述比例称取各组分并均匀混合，震荡后静置，至完全溶解，混合均匀，制得所述反胶团溶液；1.2)将固态或液态发酵制得的纳豆激酶粗提液的pH值调到4.5-8.0；离子强度调到0.1-0.2M；1.3)萃取纳豆激酶粗提液，使纳豆激酶进入反胶团溶液中得到携带有纳豆激酶的反胶团溶液：将上述步骤1.2)的纳豆激酶粗提液作为水相与步骤1.1)配制反胶团溶液混合，其混合的体积比为反胶团溶液的体积∶纳豆激酶粗提液的体积＝1∶1-1∶50，混合时间为1-10分钟，萃取操作温度为10-35℃；纳豆激酶进入反胶团溶液，得到携带有纳豆激酶的反胶团溶液；2)对得到的携带有纳豆激酶的反胶团溶液进行反萃取，使纳豆激酶从反胶团溶液中进入反萃水相：2.1)配制反萃水相，所述反萃水相组分包括反萃助剂、缓冲剂、盐和水，其重量份配比为反萃助剂∶缓冲剂∶盐∶水＝4-30∶0.5-10∶5-12∶48-98；所述反萃助剂为乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇；所述缓冲剂为磷酸盐、TRIS-HCl或甘氨酸-氢氧化钠；所述盐为氯化钾或溴化钾；2.1)将步骤1)得到的携带有纳豆激酶的反胶团溶液同反萃水相混合，其体积比为携带有纳豆激酶的反胶团溶液的体积：反萃水相的体积＝1∶1-50∶1，混合时间为1-30分钟，并在20-45℃温度下离心，分离得到纯化后的纳豆激酶水溶液。