[发明专利]一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法

摘要

本发明涉及一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域，包括：筛选出愈伤组织分化能力较强的基因型菊花品种‘七月红’长嫩茎段；在培养基MS+2.0mg·L－1 2，4－D+0.2mg·L^－16－BA上诱导获得浅绿色、颗粒细小(1毫米左右)、外观湿润、质地松软的愈伤组织，转移液体培养基中进行悬浮培养40天后，采用固液双层培养约4周后转到MS分化培养基1个月后获得1cm左右高度的再生植株幼苗并驯化移栽。本发明首次建立了小菊细胞悬浮培养与植株再生体系，为小菊的细胞及基因工程提供了培养技术。

主权项

1、一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，包括：1)愈伤组织的诱导1.1基因型的选择 取不同品种的顶端幼嫩叶片，用75％酒精灭菌30s，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗5次，切成约0.5×0.5cm2小块，接到MS+2.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L-1 6-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的培养基上；30天后，将诱导的愈伤组织转接到MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的分化培养基上，30d后选出平均每块愈伤组织分化芽数大于5个的品种；1.2愈伤组织的获得 以选择品种的无菌苗为试材，取植株中上部0.2-0.5cm长嫩茎段作外植体，接种到以MS、B5作基本培养基，添加0.2mg·L-16-BA和浓度为1.0mg·L-12，4-D的诱导愈伤组织培养基上，30d后统计愈伤组织的诱导率为100％，获得诱导的愈伤组织为浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织；2)悬浮系的建立和植株再生2.1悬浮培养取2～3g上述诱导出的浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织放入MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-12，4-D液体培养基中进行悬浮培养3天，将培养的悬浮液用高温高压灭菌过的300目的尼龙网过滤，收集过滤液进行继代培养，继代时，把培养物摇匀，分装到无菌三角瓶中，再加入同等体积的新鲜培养基，培养条件为：摇床转速100转/分钟，25±1℃，1000lux弱光下培养，共培养30-50d；2.2植株再生将上述培养的悬浮液用300目尼龙网过滤，收集过滤液转移到MS+0.2mg·L-1KT+0.2mg·L-12，4-D+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH6.2的固体培养基上，每瓶装有25～30ml固体培养基的100ml三角瓶中加1ml过滤液，在25±1℃，1000lux弱光下培养，4周后获得0.2-0.4cm大小的愈伤组织；把获得的愈伤组织转移到分化培养基MS+2.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂上，在25±1℃，3000lux下培养，每天12小时黑暗，一个月后获得0.8-1.5cm高度的再生植株。