[发明专利]马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法

摘要

本发明涉及试剂，属于马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法，其特点是：采集马铃薯生产田中具有典型马铃薯病毒症状的材料，经ELISA鉴定筛选所需毒源材料，选鉴定结果阳性，吸光值较高，再用透射电镜作辅助检验，确定毒源材料。将毒源材料分别接种于温室种植的一系列健康的指示植物进行病毒分离研究，接种后的指示植物须每隔2天调查一次，根据每组指示植物发病情况，筛选分离出需要的病毒，再经过多次接种滤去其它病毒，纯化病毒，然后用纯化的病毒接种在繁毒材料上扩繁病毒，供提纯用。

主权项

1.一种马铃薯PVX、PVY、PLRV、PVS病毒诊断试剂制作工艺方法， 其特征是：病毒抗血清的制备如下：第一步搜集病毒分离用的指示植物；第 二步采集病毒毒源，鉴定病毒种类；第三步指示植物分离并纯化病毒；第四 步指示植物病毒扩繁；第五步马铃薯主要病毒的提纯；第六步病毒提纯液免 疫家兔获得抗血清；第七步抗血清免疫球蛋白(IgG)的提取与浓度测定；第 八步抗血清免疫球蛋的酶标记；第九步马铃薯病毒检测灵敏度测试；第十步 免疫球蛋白与酶标免疫球蛋白的工作浓度测定； 实施路线 (1)马铃薯病毒的指示植物是： 表1马铃薯主要病毒繁育植物 病毒 繁毒植物 学名 马铃薯卷叶病毒PLRV 洋酸浆 Physalisfloridana 白花刺果曼陀罗 DaturaStramonium 马铃薯Y病毒PVY 洋酸浆 Physalisfloridana 马铃薯X病毒PVX 黄苗榆烟 Nicotianatabaco 马铃薯S病毒PVS 黄苗榆烟 Nicotianatabaco (2)毒源采集 采集马铃薯生产田中具有典型马铃薯病毒症状的材料，经ELISA鉴定筛 选所需毒源材料，选鉴定结果阳性，吸光值较高，再用透射电镜作辅助检验， 确定毒源材料。 (3)马铃薯主要病毒的分离、繁殖 将毒源材料分别接种于温室种植的一系列健康的指示植物进行病毒分离 研究，接种后的指示植物须每隔2天调查一次，根据每组指示植物发病情况， 筛选分离出需要的病毒，再经过多次接种滤去其它病毒，纯化病毒，然后用 纯化的病毒接种在繁毒材料上扩繁病毒，供提纯用。 将分离纯化的马铃薯病毒一部分低温贮存，作为日后试剂盒制备的病毒 毒源繁殖病毒以供提纯用。 病毒分离： PVX：汁液摩擦接种，千日红——白花刺果曼陀罗——指尖椒——千日红 ——黄苗榆烟 PVY：汁液摩擦接种或蚜虫非持久性接种，洋酸浆——黄苗榆烟 PVS：蚜虫非持久性接种，千日红——毛曼陀罗——苋色藜——德伯尼烟 PLRV：蚜虫持久性接种，洋酸浆——白花刺果曼陀罗 (4)马铃薯主要病毒的提纯 以差速离心为基础，根据不同病毒特征，采用相应方法进行提纯。 1)几种病毒提纯路线 PVX病毒 ↓ 寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，离心3,000-4,000rpm，20min ↓↓ 弃沉淀上清，离心10,000-12,000rpm，20min ↓↓ 弃上清沉淀+4％PEG缓冲液，搅拌60min，离心 10,000rpm，20min ↓↓ 上清4℃静止60min，离心10,000-12,000rpm，20min弃沉淀 ↓↓ 弃上清沉淀+4％PEG缓冲液，搅拌120min，离心 10,000-12,000rpm，20min ↓↓ 上清+提取液4℃过夜，离心10,000-12,000rpm，20min弃沉淀 ↓↓ 上清40,000rpm离心90min弃沉淀 ↓↓ 弃上清沉淀+提取缓冲液过夜 ↓ 纯病毒 pvy病毒 ↓ 寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液，三层纱布过滤，离心7,800-8,000rpm，20min ↓↓ 弃沉淀上清中加入1％TritonX-100，4℃，120min振荡离心7,800-8,000rpm，20min ↓↓ 上清中加入4％PEG缓冲液，4℃振荡60min，弃沉淀 室温下抚育60min，离心7,800-8,000rpm，20min ↓↓ 沉淀用0.02M磷酸缓冲液悬浮，加入1％TritonX-100，弃上清 4℃过夜，离心5,100rpm，10min ↓↓ 上清30％蔗糖垫层离心72,530rpm，150min弃沉淀 ↓↓ 磷酸缓冲液悬浮沉淀，0.01MEDTA，弃上清 4℃螯合240min，离心5,100rpm，10min ↓↓ 弃沉淀上清与氯化色混合密度梯度，离心128,000rpm，180min ↓↓ 分布收集病毒带加入等体积磷酸缓冲液(含0.01MEDTA) ↓↓ 弃上清磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃振荡过夜，离心5,500rpm，10min ↓↓ 弃沉淀蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min ↓ 分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心160,400rpm，60min ↓↓ 弃上清磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜 ↓ 纯病毒 PLRV病毒 ↓ 寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液液氮研磨，室温下振荡过夜 ↓ 三层纱布过滤，滤液与氯仿(1∶1)乳化5分钟，离心9,600-12,000rpm，25min ↓↓ 弃沉淀上清中加入8％PEG缓冲液，室温下搅拌120min 离心9,600-12,000rpm，45min ↓↓ 沉淀中+0.01M磷酸缓冲液，4℃过夜，离心6,200rpm，15min弃上清 ↓↓ 弃沉淀上清离心11,290rpm，20min ↓↓ 上清蔗糖垫层离心72,530rpm，120min弃沉淀 ↓↓ 磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜，离心7,840rpm，10min弃上清 ↓↓ 弃沉淀上清蔗糖垫层离心72,530rpm，120min ↓↓ 沉淀+磷酸缓冲液，4℃过夜，离心5,000rpm，10min弃上清 ↓↓ 弃沉淀蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min ↓ 分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心164,400rpm，60min ↓↓ 弃上清磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃振荡过夜，离心5,500rpm，10min ↓↓ 弃沉淀蔗糖密度梯度，离心114,500rpm，45min ↓ 分布收集病毒带，磷酸缓冲液稀释，离心160,400rpm，60min ↓↓ 弃上清磷酸缓冲液悬浮沉淀，4℃过夜 ↓ 纯病毒 PVS病毒 ↓ 寄主植物+2倍体积(w/v)提取缓冲液研磨，三层纱布过滤， 滤液离心5,000-6,000rpm，20min ↓↓ 上清+4％PEG和1％TritonX-100，4℃振荡弃沉淀