[发明专利]降低实时荧光PCR仪器定量分析系统误差的分析方法及应用

摘要

本发明公开了一种降低实时荧光PCR仪器定量分析系统误差的分析方法及应用，用荧光强度R_n达到设定的阈值时模板的扩增时间t_n为测量指标，按式lnX₀＝－ln(1+E)(t_n/t_c)+lnK计算X₀值，绘制lnX₀～t_n的标准曲线，再计算出样品模板的初始拷贝数，测量t_n值时，在仪器中设置连续扫描测量模式，对荧光信号强度进行实时检测，设定在每次循环的模板延伸阶段中，每0.01秒～10.00秒的范围内选定特定的时间间隔对反应管中的荧光信号强度R_n检测一次，得动力曲线R_n～t，所达到阈值的荧光信号对应的时间为t_n值，解决了现有分析方法系统误差大等问题，广泛应用研究基因表达、基因工程、药物疗效、病原体检测和转基因成分检测等领域。

主权项

1、一种降低实时荧光PCR仪器定量分析系统误差的分析方法，分析过程中包括合成一对引物和一个荧光探针，和使用所述的引物、探针及其它聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系，从待测标本中提取DNA或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入前述的反应体系中，经混合后进行PCR扩增和荧光信号测定，其特征在于：(1)用荧光强度Rn达到设定的阈值时模板的扩增时间tn为测量指标进行实时荧光定量分析，按式(1)计算X0值：lnX0＝-ln(1+E)(tn/tc)+lnK………(1)式(1)中，E为扩增效率，K为常数，X0是参与扩增反应的每种模板的初始拷贝数，tc是设定的实时荧光PCR每次循环所用的时间；根据lnX0与tn间的线性定量关系，用式(1)计算X0值，测定已知X0的标准品的tn，制作lnX0～tn的标准曲线，并测定样品的tn，再从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数；(2)测量tn值时，在实时荧光PCR仪器中设置连续扫描，对PCR反应管的荧光信号强度进行实时检测，设定在每次循环的模板延伸阶段中，在每0.01秒～10.00秒的范围内选用特定的任意时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次，得仪器自动记录的其与时间t的动力学曲线Rn～t，曲线上出现达到阈值的荧光信号所对应的时间，即为相应的tn值。