[发明专利]单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法

摘要

一种单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法，采用全内反射荧光探测系统，通过在探测过程中改变激光光束的入射角从而改变激发场的渗透深度，根据单分子荧光成像强度随渗透深度的变化函数关系，重构出荧光分子之间的纵向间隔、荧光分子的绝对纵向位置和荧光分子半径大小的信息。本发明可以实现荧光分子的纳米级的纵向超分辨，而且具有实验操作简单、快速、激发和探测对样品无接触，样品在固体状态和液态环境下均可进行探测。一次测量可以得到多个参数。

主权项

1、一种单分子荧光样品快速纵向超分辨的方法，其特征在于该方法是利用全内反射荧光探测系统对被测单分子荧光样品(9)进行全场成像，重构出单个荧光分子之间的纵向间隔、荧光分子的绝对纵向位置和荧光分子半径的信息，其具体步骤是：①制备单分子荧光待测样品(9)；②在一台全内反射荧光探测系统的载物台上放置该荧光样品(9)，调节该系统使之正常工作，激光器(1)发出的激光束由光纤(2)导引，经过该系统同光轴地垂直照射荧光样品(9)，并使样品(9)在CCD(10)成清晰的图像；③调节光纤精密平移架(3)，使激光束通过光纤(2)离轴地入射，经该系统的成像物镜(7)在全内反射荧光成像方式下对被测单分子荧光样品(9)进行照明、探测成像，并记入射角为θ1，相应的渗透深度为d1，入射角与渗透深度之间的关系式为$d_1={\lambda }_0/\left(4\pi \sqrt{n_1^2{\sin }^2{\theta }_i-n_2^2}\right)$ 即渗透深度d1与离轴量x1之间的关系为$d_1=\frac{{\lambda }_0}{4\pi \sqrt{x^2/f^2-{n_2}^2}}$ 式中：n1为物镜浸没油折射率，n2为样品折射率，x为离轴量，f为所用物镜的焦距，λ0为入射光的波长；④用CCD记录荧光强度图1，其中包括各个单分子的强度信息；⑤进一步增大入射角到θ2，相应的渗透深度为d2，使d1和d2之间满足关系式d1＝2d2，并用CCD记录此时的荧光强度图2；⑥从荧光强度图1和荧光强度图2中获得待测样品(9)中各个荧光分子的最大成像强度，分别记为F1d1、F1d2，F2d1、F2d2，F3d1、F3d2……，将荧光强度图1或荧光强度图2中不同分子的荧光强度进行比较，得到荧光分子之间的相对纵向间隔$\mathrm{\Delta c}{=d}_1·\ln \frac{{F_i}^{d_1}}{{F_j}^{d_1}},$ i，j表示第i个分子和第j个分子；⑦将同一分子在荧光强度图1和图2中的荧光强度进行比较，以确定单个荧光分子的绝对纵向位置$c_i={-d}_2·\ln \left[{F_i}^{d_2}\frac{{1-k}^2}{4k}\right]$ 和荧光分子的半径$R={-d}_2\ln \frac{1-k}{1+k},$ 这里$k={\left[{F_i}^{d_1}\right]}^2/{F_i}^{d_2}·{2I}_0·d_1.$