[发明专利]黄曲霉毒素的检测方法

摘要

本发明涉及一种黄曲霉毒素的检测方法，更确切的说它是利用黄曲霉毒素单克隆抗体制备的免疫亲和柱及荧光光度计来检测食品中黄曲霉毒素的方法，属生物细胞学及微生物菌类毒性代谢产物检测方法技术领域。本发明方法的是：首先制备制备单克隆抗体，单克隆抗体的制备要通过小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤筛选及获取杂交瘤细胞株、采集单克隆抗体等步骤来获得，然后利用上述的单克隆抗体来制备免疫亲和柱，最后将食品或饲料磨细后用甲醇/水溶液提取其中的黄曲霉毒素，经过过滤，将液体样品流经亲和柱达到净化后，再用甲醇将亲和柱上的AFT洗脱下来，然后用荧光分光光度计测定样液中黄曲霉毒素的含量。

主权项

1.一种黄曲霉毒素的检测方法，它是以单克隆抗体免疫亲和柱为分离装置，用荧光光度计为检测工具的检测方法，该方法的特征是具有以下检测过程和步骤：A.亲和柱的准备和制备：a.制备单克隆抗体，单克隆抗体的制备通过小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤筛选及获取杂交瘤细胞株、采集单克隆抗体步骤来获得，其主要步骤为：(a).小鼠免疫：以黄曲霉毒素B1(简称AFB1)和牛血清蛋白BSA的偶联复合物为免疫原(抗原)免疫小鼠；用50ug/50ul抗原(AFB1-BSA)与50ul弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射每只10周龄BALB/C雄性小鼠，一个月后进行加强免疫，腹腔注射50ug/50ul抗原与弗氏不完全佐剂乳化后的抗原，再经过2个月后作最后一次免疫，采用尾静脉注射剂量为50ug/50ul抗原，4天后取出小鼠的脾脏细胞，进行下一步的细胞融合；(b)细胞融合：免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞X63-Ag8.653以10∶1混匀，借助50％聚乙二醇(PEG1500)进行融合，融合细胞用HAT选择培养基于5％CO2，37℃培养箱中培养；7天后更换HT培养液，第10天进行阳性筛选；(c)杂交瘤筛选及获取杂交瘤细胞株：进行阳性孔筛选采用间接非竞争酶联免疫吸附法与排除法结合的方法；将筛选得到的强阳性细胞进行有限稀释克隆化，反复克隆多次，获得多株能稳定分泌抗黄曲霉素AFT抗体的杂交瘤细胞株，对其中的2A12进行系统鉴定后待用；(d).采集单克隆抗体：将上述2A12杂交瘤细胞株扩大培养后，注入预先注射有降植烷的小鼠腹腔内，使其生长腹水瘤；10天后采集腹水，该腹水中含有大量单克隆抗体；保存好该单克隆抗体备用；b.利用上述的单克隆抗体来制备免疫亲和柱，其步骤如下：(a)称取适量溴化氰活化的的琼脂糖干粉：用1毫升1M的稀盐酸使其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质；(b).将溶胀后的琼脂糖凝胶在偶联缓冲液中与上述制备得到得单克隆抗体均匀混合，并在室温下震荡充分反应1小时，偶联缓冲液由0.1M NaHCO3 和0.5MNaCL配成，PH值为8.3；(c).除去未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体；(d).封闭琼脂糖凝胶珠上残余的活性基团，用0.1MPH值为8.0的Tris-HCl处理偶联复合物，并静置2小时；(e).用含有0..5MNaCl，PH值为4.0的0.1M乙酸缓冲液淋洗偶联复合物一次，再用含有0.5MNaCl，PH值为8.0的0.1MTris-HCl缓冲液淋洗一次，如此循环反复清洗3次；(f).最后将琼脂糖-抗体复合物填充入55×6mm层析柱中，即制成免疫亲和柱。平衡备用；B.食品中黄曲霉毒素的分离与检测方法：称取适量样品，用一定比例的甲醇/水提取其中的AFT，经过过滤步骤并进行适当稀释之后，将液体样品流经亲和柱达到净化的目的，再用甲醇将亲和柱上的AFT洗脱下来，在洗脱液中加入溴溶液衍生，提高检测灵敏度，然后用荧光分光光度计测定样液中黄曲霉毒素的含量。