[发明专利]重组人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的构建、表达与纯化方法

摘要

本发明涉及医药生物工程技术领域，是包括涉及编码人甲状旁腺激素小肽的cDNA，和利用其表达载体制备人甲状旁腺激素的方法。本发明将化学合成的重组人甲状旁腺激素(1－34)基因用PCR扩增后，克隆至表达载体pET－35b(+)，使重组人甲状旁腺激素(1－34)融合于纤维素结合结构域(CBD_clos)的羧基端，并得到高效表达。融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后，经Factor Xa裂解释放出rhPTH(1－34)，再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1－34)纯品。每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1－34)。经质谱测定，所得样品的分子量为4117.0道尔顿，与rhPTH(1－34)理论分子量一致。本发明极大程度上丰富了该多肽在医药生物工程技术领域的研究和开发。

主权项

1.一种重组人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的构建、表达与纯化方法，其特征在于：a.重组人甲状旁腺激素的构建：以下述基因序列为模板，CCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGACGTACACAACTTCTAACTCGAG，实线处分别为SacII、XhoI的酶切位点，虚线处序列编码Factor Xa识别位点Ile-Glu-Gly-Arg↓，以GGACTGCCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTC为上游引物序列，实线处为SacII的酶切位点，通过聚合酶链式反应合成重组人甲状旁腺激素基因；b.通过聚合酶链式反应合成的重组人甲状旁腺激素基因经SacII、XhoI双酶切后与经SacII、XhoI双酶切的表达质粒pET-35b(+)连接，将连接后的重组质粒转化E.coli DH5α宿主菌进行重组人甲状旁腺激素的表达；c.表达的重组人甲状旁腺激素以纤维素树脂(CBIND 200 Resin)亲和层析分离纯化。