[发明专利]间接ELISA方法快速检测近江牡蛎病原类立克次氏体

摘要

间接ELISA方法快速检测近江牡蛎病原类立克次氏体。主要解决能简单、快速、敏感性高、特异性强、重复性好的检测出引起近江牡蛎发病死亡的类立克次氏体。其检测步骤依次如下：待检材料的制备、抗原的制备、免疫血清的制备及非特异性抗体的吸收、间接ELISA工作浓度的确定、间接ELISA方法的敏感性和特异性验证，最后进行近江牡蛎类立克次氏体病原的检测。本发明能有效检出感染材料中的类立克次氏体病原，适用于大批量发病样本的检测，可用于类立克次氏体感染的早期快速诊断及流行病学研究。

主权项

1、间接ELISA方法快速检测近江牡蛎病原类立克次氏体，其特征在于检测步骤依次如下：一、待检材料的准备分别取近江牡蛎的鳃，外套膜，肝胰腺研磨后加入3倍体积的生理盐水，离心取上清液检测；二、抗原的制备1.类立克次氏体的初步分离：取近江牡蛎鳃组织，剪碎后加入pH为7.4的PBS，于匀浆器内匀浆10min，重复匀浆三次，先低速离心除渣，4℃下500g离心10min，取上清液，沉淀加入PBS后重新研磨匀浆，4℃下400g离心20min，取上清液，弃沉淀，将上两步的上清液收集后4℃下11000g离心60min，用吸管吸去浮在管壁上的脂肪，弃掉上清液，沉淀加入PBS后，重新匀浆，4℃下500g离心20min，取上清液置于23％蔗糖和10％泛影葡胺的混合溶液之上，4℃下25000g离心60min，将沉淀轻微匀浆后，PBS稀释，4℃下400g离心10min，取上清液，4℃下11000g离心60min，取沉淀，用9mlPBS稀释为类立克次氏体粗提液，离心后的每一步含有类立克次氏体的液体涂片，Giemsa染色，光学显微镜观察；2.泛影葡胺密度梯度离心纯化类立克次氏体：用国产泛影葡胺(60％)配制15％、20％、25％、30％、35％的泛影葡胺，按浓度由高到低依次加入离心管中，形成非连续梯度，将类立克次氏体粗提液加在泛影葡胺密度梯度上，4℃下90000g离心60min，形成5条窄的乳白色的条带，分别取出经电镜观察，证明20％与25％之间和25％与30％之间基本上为纯净的类立克次氏体；三、免疫血清的制备及非特异性抗体的吸收1.多克隆抗血清的制备：类立克次氏体经超声处理后，用PBS调整为1μg蛋白/μl，加等量的弗氏完全佐剂进行乳化，在Balb/c小鼠4个位点分别皮下注射100μl免疫乳化剂，4周后作加强免疫，腹腔注射100μl不加佐剂的抗原，10天后在小鼠尾静脉采血，检测抗体；2.非特异性抗体的吸收：取正常贝的闭壳肌，加入TN缓冲液其中含有PMSF1mmol/dm3，匀浆8000rpm，10min，经3000rpm离心5min，取上清液再经5000rpm离心20min，上清液经10000rpm离心1h，取沉淀用于非特异性抗体的吸收，方法参照Sambrook等；四、间接ELISA工作浓度的确定1、免疫血清抗体的效价固定抗原的浓度10μg/ml，系列稀释抗血清的浓度1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800用间接ELISA技术测定抗体效价及最佳工作浓度；2、采用交叉连续稀释法确定免疫血清的最佳工作浓度，抗原浓度恒定100μg/ml，调节免疫血清的稀释度1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800。经间接ELISA反应后，获得在λ＝450处的吸收值；制备的免疫血清用间接ELISA测定的效价为1∶6400v/v，最佳工作浓度取最大和最小吸收值的中间值，为0.6，对应的血清稀释度为1∶3200；五、间接ELISA方法的敏感性和特异性验证1、敏感性根据确定的一抗最佳工作浓度和二抗推荐的工作浓度，系列稀释抗原浓度，以确定最小检测的抗原浓度；免疫血清抗体的浓度恒定1∶3200V/V；酶标二抗的工作浓度恒定1∶20000V/V，而抗原的浓度改变范围为1ng/ml-50μg/ml，测定免疫血清对抗原的灵敏度；2、特异性选择溶澡弧菌V.Alginolyticus、嗜水气单胞菌Aeromonas Hydrophila、大肠杆菌EschenrichiaColi、金黄色葡萄球菌Staphylococcus Aureus、枯草杆菌Bacillus Subtilis与多克隆抗血清交叉反应来判断抗血清的特异性，实验细菌的浓度为106/ml；由类立克次氏体免疫Balb/c小鼠所得的抗血清与类立克次氏体的效价为1∶12800，与其它菌的效价较低，都低于1∶200，通过吸附处理后，抗血清对类立克次氏体的效价降低至1∶6400，与其它菌无交叉反应，为高度专一的抗类立克次氏体血清；六、近江牡蛎类立克次体病原的检测于发病高峰期取近江牡蛎，取其外套膜和鳃部位组织，用无菌PBS匀浆，离心取上清液，100℃煮沸10min，4℃保存；用碳酸缓冲液pH9.6 0.01M将可溶性抗原稀释成蛋白含量为100μg/ml，于微量反应板各孔加100μl稀释的可溶性抗原，4℃18小时后取出，弃去包被液，用PBST洗涤一次，加入3％牛血清白蛋白-0.02％T，37℃作用2小时后，甩干封闭液，用PBST洗涤三次，10min/次，并甩干；加入被检血清：用PBS把血清用倍比稀释后加入反应孔，每孔100μl，37℃作用1小时后用PBST洗涤三次，10min/次，并甩干；加入酶标二抗，每孔100μl，37℃作用1小时后用PBST洗涤三次，3min/次，并甩干；加入四甲基联苯胺TMB显色液，每孔100μl，室温作用15min后加3M NaOH终止反应，测定OD450值，或根据阳性及阴性对照直接判定结果；其中显色液配方：碳酸缓冲液(pH9.6)：NaHCO3 2.93g，Na2CO3 1.59g蒸馏水1L；封闭液：3％牛血清白蛋白-0.02％Tween20；稀释液：PBS(pH 7.4)-0.05％Tween20，配方为： NaCl 8g，Na2HPO4-12H2O 20g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，H2O 1L；底物溶液：0.2M Na2HPO4 28.4g/L 25.7ml， 0.1M 柠檬酸 19.2g/L 24.3ml H2O 50ml 30％H2O2临用前加入 15μl TMB临用前加入 40mg。