[发明专利]套式PCR法检测栉孔扇贝病原类立克次氏体

摘要

套式PCR法检测栉孔扇贝病原类立克次氏体，主要解决能早期、快速、灵敏和特异性强的检测引起栉孔扇贝发病死亡的类立克次氏体。其检测方法，首先从扇贝组织中纯化出类立克次氏体；然后根据我们已完成的栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16SrDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成内引物和外引物，引物序列为：外引物：Out1. 5’－CTTCTTCGGAGGTGTATTCT－3’，Out2.5’－T TGCGACCGTACTCCC－3’；内引物：In1.5’－AATCCGAA GACCCGACGTTTA－3’，In2.5’－GCCAAACTTGAGA TCGGAAGA－3’。制备栉孔扇贝类立克次氏体DNA模板；最后进行套式PCR扩增来检测栉孔扇贝病原类立克次氏体。应用本发明定期抽样检测，可早期发现类立克次氏体感染，便于对疾病早期诊断，及时采取措施预防疾病的暴发。

主权项

1、套式PCR法检测栉孔扇贝病原类立克次氏体，其特征在于检测步骤如下：一、先从扇贝组织中纯化出类立克次氏体类立克次氏体纯化方法：1、差速离心粗提：感染类立克次氏体的栉孔扇贝幼贝用无菌的缓冲液PBST，PBS中加Tween 80成0.1％终浓度，PBS，pH7.4冲洗，解剖取鳃和外套膜于70％酒精中快速过一下后置于PBS中，用PBS洗三次后于少量PBS中用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液用PBS稀释后作高速离心11,000g、40min、4℃，Sorval rotor 05，弃上清，沉淀用PBS悬浮，悬液作低速离心700g，20min，4℃，保留上清A，沉淀匀浆后作低速离心500g，20min，4℃，保留上清B，合并两次低速离心上清A与B，再次作高速离心，11,000g，40min，4℃，弃上清，沉淀用PBS悬浮，悬液作低速离心500g，20min，4℃，弃沉淀，上清作高速离心，11,000g，40min，4℃后，用少量PBS悬浮沉淀，悬液作低速离心500g，20min，4℃上清即粗提的类立克次氏体；2、蔗糖垫离心：将粗提的类立克次氏体悬液铺于含23％蔗糖-16％泛影葡胺的溶液上4℃下离心15,000g，1h，23％蔗糖-16％泛影葡胺的溶液用PBS配制，再用少量PBS悬浮沉淀后缓慢地用PBS稀释后作高速离心11000g，40min，4℃，沉淀用少量PBS悬浮即初纯的类立克次氏体，取少量作光镜和透射电镜检查；3、泛影葡胺密度梯度离心：用PBS分别配制15％，20％，25％，30％，35％的泛影葡胺溶液，于12.5ml的离心管中由下向上，由重向轻小心地铺密度梯度，每一梯度铺1.9ml，将1.5ml初纯的RLO悬液铺于泛影葡胺密度梯度上，作超速离心95,000g，1h，4℃Beckman SW41 Ti，收集20％-25％乳白色类立克次氏体区带，用PBS缓慢稀释后作高速离心25,000g，40min，4℃以去除泛影葡胺、浓缩样品，沉淀用少量PBS悬浮，即纯化的类立克次氏体；二、根据我们已完成的栉孔扇贝类立克次氏体在细菌分类学上具有保守功能的16S rDNA序列中的三段特有的DNA序列设计合成内引物和外引物引物序列为：外引物：Out1.5’-CTTCTTCGGAGGTGTATTCT-3’Out2.5’-TTGCGACCGTACTCCC-3’内引物：In1.5’-AATCCGAAGACCCGACGTTTA-3’In2.5’-GCCAAACTTGAGATCGGAAGA-3’；三、制备栉孔扇贝类立克次氏体DNA模板1、类立克次氏体粗提：取约1g扇贝消化腺或鳃匀浆，悬浮于1.5ml PBS中，13000rpm离心30分钟，沉淀再次匀浆于350μl的去离子水中，3000rpm离心5min，取上清300μl；2、模板提取：粗提的类立克次氏体中加入300-400μl溶液I，混匀，置室温20min后冰上置10min→4000rpm离心2min→弃上清，加600μl溶液II，混匀，4000rpm离心2min→弃上清，加600μl溶液II再洗一次→4000rpm离心2min，弃上清→37℃烘干20-40分钟后加20μl去离子水，56℃ 10min→4000rpm离心2min，上清即DNA模板，其中溶液I和溶液II取自军事医学科学院微生物流行病学研究所玻璃酚核酸提取试剂盒；四、进行套式PCR套式PCR：样品反应体系均为25μl，含2.5μl 10×buffer Sangon promega，上海，200mMdNTP，3mM Mg2+，1U Tag酶Sangon promega，上海，第一轮反应体系含外引物Out1和Out2各1mM，所提模板3μl，第二轮反应体系含内引物In1和In2各1mM，第一轮PCR产物50倍稀释液1μl，第一轮扩增条件为：94℃变性35sec，57℃煺火30sec，72℃延伸30sec，重复30个循环后72℃，7min，循环前95℃预变性3min，第二轮扩增的条件为：94℃变性35sec，59℃煺火30sec，72℃延伸20sec，重复30个循环后置72℃，7min，循环前95℃预变性3min，每次检测都平行设一阴性对照，即以水代替模板；五、结果观察：第二轮扩增产物用2.5％的琼脂糖胶含0.5％溴化乙淀电泳，紫外照射下观察，Marker用TaKaRa的DL2000。