[发明专利]蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的快速测定技术

摘要

本发明涉及利用毛细管电泳技术快速测定蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的方法，属于应用生物技术领域。本发明的方法包括用毛细管电泳的方法测定各种蛋白酶解产物的抑制ACE活性的IC₅₀值，根据IC₅₀值的大小，判断各种海洋蛋白酶解物的抑制ACE的活性，IC₅₀越低，表明该蛋白酶解物抑制ACE酶的活性越强，抑制ACE的降血压活性肽的含量越高。本发明将毛细管电泳技术应用于从蛋白酶解产物中筛选抗高血压活性肽，重复性好，灵敏度高，IC₅₀值测定准确，与以往的色谱法相比，大大减少了测定IC₅₀值所用的时间，而且不需要价格昂贵的有机溶剂作为流动相。

主权项

1.蛋白酶解物的血管紧张素转化酶抑制活性的快速测定技术，其特征在于用毛细管电泳的方法测定各种蛋白酶解产物的血管紧张素转化酶抑制活性的IC50值，具体包括如下步骤：(1)酶反应系列样品反应液包括：10μl底物Hip-His-Leu 1mM，0.8mU的血管紧张素转化酶分别和浓度为0.03～40mg/ml的10μl蛋白酶解产物，上述样品反应液都用pH8.3含0.3M NaCl的100mM的硼酸缓冲液配制，反应液均在37℃反应30min，然后用0.1％三氟乙酸10μl中止反应，底物经血管紧张素转化酶作用后产生单独的马尿酸和His-Leu二肽；(2)检测上述血管紧张素转化酶抑制反应产物直接在毛细管电泳仪上进行检测，毛细管电泳仪为Beckman Coulter P/ACE MDQ装置，配备有PDA检测器，数据采集、分析、系统控制用P/ACE MDQ软件，上样压力为1psi，时间为5秒，电泳电压20kV，紫外吸收为228nm，电泳时间5分钟，电泳缓冲液为20mM的硼酸缓冲液pH9.18，每测一个样品之后用缓冲液冲洗毛细管1分钟，底物和产物马尿酸分别在2.5分钟和3.5分钟出峰，根据软件计算马尿酸的峰面积；(3)血管紧张素转化酶抑制活性IC50值的计算马尿酸配制成不同浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，2，4，6mM，通过毛细管电泳测定其峰面积与马尿酸浓度的线性关系：峰面积＝K×Chip+NACE活力(umol/min)＝V×Chip÷t上述公式中V：反应体积，t：反应时间，K：根据峰面积和马尿酸浓度求出的曲线常数，Chip：马尿酸浓度，N：马尿酸浓度曲线与Y轴的交点；通过血管紧张素转化酶作用，反应混合物中不含任何抑制剂，从底物Hip-His-Leu释放出来的马尿酸HA的量被定义为100％血管紧张素转化酶活力。将所要测定血管紧张素转化酶抑制活力的抑制剂系列稀释成不同浓度，分别与底物和酶共同反应，然后根据所产生的马尿酸的峰面积，来计算抑制剂的IC50值；抑制50％的ACE活力的海洋蛋白酶解产物的量被定义为该酶解产物的抑制活力；IC50值的计算采用线性对数法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))对Log(水解产物浓度mg/ml)作图，所得直线与X轴的交点对应的值为M，10M为酶解产物抑制ACE活力的IC50值。