[发明专利]真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及其制备方法

摘要

一种真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及其制备方法，通过文库筛选和EST序列分析，克隆出真鲷抗菌肽(hepcidin)基因，将该基因重组到酵母表达载体pPICZαA，构建成抗菌肽基因表达质粒pPICZ－rsbHEPC1，转化毕赤酵母后，获得了稳定表达真鲷抗菌肽的酵母菌株。细菌生长抑制实验表明重组抗菌肽对大肠杆菌，绿脓杆菌和嗜水气单胞菌等4种细菌均具有剂量依存的抑制活性。本发明首次构建了鱼类抗菌肽(hepcidin)基因酵母表达质粒并研制了重组抗菌肽表达产物，该表达质粒在酵母体内表达稳定，重组抗菌肽分子量小，抑菌活性明显，适宜用作鱼类等水产动物的饲料添加剂。本发明适用于各种鱼类抗菌肽基因克隆和表达载体的构建，生产的基因工程鱼类抗菌肽可作为饲料添加剂，用于鱼类等水产动物的疾病防治。

主权项

1、一种真鲷抗菌肽基因和重组酵母表达载体及制备方法，其特征在于它的真鲷抗菌肽基因的克隆主要包括cDNA文库构建、EST序列测定和DNA序列分析与比对：cDNA文库构建：用TRIzol试剂盒从真鲷脾脏中提取总RNA，用OligotexTM离心柱试剂盒分离Poly-(A)RNA，用pBluescript II XR cDNA文库试剂盒构建cDNA文库；EST序列测定：用快速微量制备方法制备质粒DNA，质粒制备在96孔板上完成；用T3定序试剂盒测定cDNA片段的序列，用T3和T7引物从cDNA片段的两端分别进行测序，从而获得全长序列；DNA序列分析与比对：在测定EST序列后，用Cross-Match软件掩盖载体序列，然后将从cDNA文库中获得的序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，用PHRAP聚类程序鉴定共同序列和单一序列；用BLASTN和BLASTX程序计算我们获得的cDNA克隆片段与GENBANK序列数据库中已存的DNA序列的同源性。