[发明专利]快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法

摘要

一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于包括下列步骤：(1)准备DNA；(2)利用PCR方法采用三组特殊设计的四引物对DNA进行扩增；(3)凝胶电泳；(4)观测结果。本发明应用特殊设计的引物，利用该基因检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物的数量和大小来判断病人有无与吉非替林(Gefitinib)[商品名：易瑞沙(Iressa)]疗效有关的EGRF基因点突变，及时指导临床用药，真正做到对症下药。本发明的特点是：1.简单，不需测序；便宜，一般分子生物学实验室或检验室就可操作；3.灵敏度高，可以检测到测序漏诊的病例。

主权项

1、一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于包括下列步骤：(1)、准备DNA①、从人体肺部采集病变组织；②、从病变组织中获取DNA；(2)、对DNA进行扩增利用PCR扩增方法，采用下列三组对应外显子DNA片段的至少一组四引物进行扩增：第18外显子点突变DNA片段的四引物为：内源有义AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；内源反义GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有义GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反义CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外显子L858R点突变DNA片段的四引物为：内源有义CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；内源反义CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有义CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外显子L861Q点突变DNA片段的四引物为：内源有义GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；内源反义TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有义CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具体步骤为：①、将上述每组四引物分别与获取的DNA、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、双重蒸馏水混合构成单独的反应体系；②、分别对各反应体系重复进行PCR循环，将DNA量扩增至凝胶电泳可观察即可；(3)、凝胶电泳采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳；(4)、观测结果根据凝胶电泳对应泳带中所显示的条带数量和大小来判断对应外显子位置是否发生点突变以及突变类型，具体判断方法如下：①、如果观察到某外显子泳带中出现三条DNA条带时，则判定有杂合子突变；②、如果观察到某外显子泳带中仅出现两条DNA条带时，则用较小条带的大小与下列对应组中特异性产物的理论值对比，根据接近程度来判断是纯合子突变或是正常特异性，三组特异性产物的理论值如下：A、第18外显子点突变DNA片段的特异性产物理论值为：正常特异性产物大小：198个碱基；突变特异性产物大小：270个碱基；B、第21外显子L858R点突变DNA片段的特异性产物理论值为：正常特异性产物大小：118个碱基；突变特异性产物大小：178个碱基；C、第21外显子L861Q点突变DNA片段的特异性产物理论值为：正常特异性产物大小：100个碱基；突变特异性产物大小：192个碱基。